Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus L.-SAT-D3- продуцент моноклональных антител к стафилококковому альфа-токсину (САТ)

(51) 12 5/16 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ . .-3- ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К СТАФИ-ЛОКОККОВОМУ АЛЬФАТОКСИНУ (САТ)(57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к гибридомной технологии, и касается получения моноклональных антител к нативной молекуле стафилококкового токсинус помощью новой гибридомы, которые могут быть использованы в научно-исследовательских,биотехнологических и медицинских целях. Штамм гибридных культивируемых клеток животных 3 -продуцент моноклональных антител к стафилококковому альфа-токсину . Предложенный штамм является высокопродуктивной и стабильной гибридомой,продуцирующей высокоспецифичные МКА против нативной молекулы , что позволяет использовать МКА для конструирования диагностических тест-систем.(72) Тлеулиева Райхан Беляев Николай Николаевич(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Центр биологических исследований Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан 16834 Изобретение относится к области иотехнологии,а именно к гибридомной технологии, и касается получения моноклональных антител (МКА) к стафилококковому альфа-токсинус помощью новой гибридомы,которые могут быть использованы в научно-исследовательских,биотехнологических и медицинских целях. Известны гибридомы, продуцирующие МКА к. Для получения данных антител использована инактивированая форма . Данные гибридомы,полученные путем слияния спленоцитов мышей/ миеломными клетками 3653,секретируют МКА относящиеся кклассу иммуноглобулинов. Недостатком этих гибридов является низкая продукция антител. В асцитной жидкости титр антител не превышал 11000.-//.-198624. .401-411). Известны гибридомы,продуцирующие мышиные МКА к , полученные иммунизацией инактивированным олигомером 12 и 3 альфа-токсоидом и гибридизацией спленоцитов и миеломы -8-653. Получено 4 активные гибридомы,секретирующие моноклональные антитела, реагирующие с 12 и 3 альфатоксоидом, а также с нативной формой 3 .( .,.,.,.а-12 а//. . . .-1985. -260. .443447). К недостаткам данных гибридов относится то,что отсутствует характеристика МКА, в частности,перекрестная реактивность с другими родственными токсинами золотистого стафилококка, например, с энтеротоксином А, не определена продуктивность штаммов в культуральной среде. Задачей изобретения является получение высокопродуктивной и стабильной гибридомы,продуцирующей высокоспецифичные МКА против нативной молекулы , что позволит использовать МКА для конструирования диагностических тест-систем. Штамм гибридных культивируемых клеток животных 3 продуцент моноклональных антител к стафилококковому альфа-токсину . Предложенный штамм депонирован в криобанке Института молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина под редакционным номером - 2. В основе изобретения лежит слияние клеток миеломной линии 638.653 со спленоцитами и лимфоцитами из региональных лимфоузлов мышей,коньюгированным с активированной целлюлозой по методу Лехтцинд Е.В., Гурвич А.Е. Синтез высокоемкого иммуносорбента на основе суспензии целлюлозы //Бюлл. экспер. биол.1981.7. .68-70. Инбредных мышей линии/ иммунизируют по следующей схеме. 20-30 мкг внутрибрюшинно, трехкратно с интервалом 2 недели. Бустерную инъекцию проводят через 2 недели по 5-10 мкг неконъюгированногов хвостовую вену. Слияние клеток проводят на 3-й день по методу. . , 1984. Миеломные клетки линии 363.8.653 гибридизуют со спленоцитами и клетками из лимфоузлов в соотношении 12 в присутствии 0,3 мл 50 гюлиэтиленгликоля (ПЭГ) (М.м. 1500) и 10 диметилсульфоксида при постоянном перемешивании. По истечении 1 мин клеточную суспензию разбавляют 10 мл бессывороточной среды 1 1640 в течение 5 мин. Затем клетки разбавляют еще раз 4-5-кратным объемом культуральной среды и осаждают центрифугированием. Осадок ресуспендируют в 50-60 мл селективной среды (ГАТ), состоящей из питательной среды -1640, содержащей 20 фетальной сыворотки коров, 4 мМ -глутамина, 25 мкМ 2 меркаптоэтанола, 50 мкМ гипоксантина, 0,2 мкМ аминоптерина и 8 мкМ тимидина. Суспензию клеток вносят в 96-луночные микропланшеты, содержащие предварительно внесенные за 24-48 ч перитонеальные макрофаги. Тестирование гибридом на продукцию антител проводят с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Гибридому -3 клонируют 5 раз методом лимитирующих разведений, переводят в массовую культуру и замораживают в жидком азоте. Морфологические признаки. Культура состоит из крупных округлых клеток, сходных по морфологии и размерам с исходной родительской миеломной линией 363.8.653. Культуральные свойства. Культивирование гибридных клеток проводят в пластиковых флаконах или в чашках Петри в среде 1-1640 или ., содержащей 10 эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мМ -глутамина, 0,05 мкМ 2 меркаптоэтанола, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 МЕ/мл пенициллина. Гибридома Т -3 растет в виде монослойно-суспензионной культуры. Посевная доза - 100-200 тыс. клеток в 1 мл. Культуру пассируют через 36 часов в соотношение 13-14. Контаминация. При длительном наблюдении и посевах на питательные среды бактерии и грибковые загрязнения в культуре не обнаружены. Заражение микоплазмой не выявлено. Криоконсервация. Для длительного хранения клетки штамма консервируют по 2-10106 кл. в 1 мл эмбриональной телячьей сыворотки с добавлением 10 ДМСО и хранят в жидком азоте. Жизнеспособность после размораживания составляет 70-80 (окраска трипановым синим). Характеристика полезного продукта штамма-3. Моноклональное антитело,продуцируемое клетками штамма -3 относится кподклассу. Наработку антител производят. Антитела осаждают из культуральной среды насыщенным раствором сульфата аммония с последующей ионообменной хроматографией на-3 был использован непрямой вариант ИФА. Твердофазный ИФА проводят по Нго Т.Т. Иммуноферментный анализ. Под ред.Т.Т.Нго. Г.Ленхоффа, М., Мир, 1988, с.10-32. Кэтти Д., Ранкундалия Ч. Иммуноферментный анализ. Антитела. Методы. Кн.2. М.,1991,с.152-238,учитывая рекомендации применительно к МКА. На 96 луночные полистироловые планшеты наносят антиген, растворенный в 10 мМ карбонатбикарбонатном буфере (рН 9,0-9,6) в концентрации 3-5 мкг/мл, в течение 2 ч при комнатной температуре или 18 ч при 4 С. Затем планшеты отмывают от несвязавшегося с пластиком антигена. Для устранения неспецифической сорбции на пластик его обрабатывают 0,2 раствором бычьего сывороточного альбумина (ВСА) или 0,5 раствором желатина в том же буфере. После 2-хчасовой инкубации планшеты отмывают и вносят в лунки супернатант культуры клеток штамма 3. Инкубируют планшеты при 4 С в течение ночи или 2 ч при комнатной температуре. После 3-хразовой отмывки планшеты инкубируют с конъюгатом (антивидовое антитело, меченное пероксидазой хрена) 2 ч при комнатной температуре. В качестве субстрата реакции используют офенилендиамин,растворенный в цитратнофосфатном буферном растворе, рН 5,0 в присутствии 0,01 Н 2 О 2. Реакцию останавливают через 30-50 мин добавлением 4 раствора 24 и измеряют оптическую плотность при 492 нм. Для отмывок используют фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий 5 мМ 2-4 и 150 мМс 0,1) твином-20 или тритоном Х-100. Пример 1. Для оценки продуктивности штамма-3 определяют титр антител и культуральном супернатанте с помощью непрямого ИФА (фиг.1). Полученные данные показывают, что он составляет 178000 для культуральной жидкости. Пример 2. Изотипический анализ проводят методом ИФА с помощью коммерческих антисывороток, моноспецифичных по отношению к различным подклассам иммуноглобулинов мыши. Штамм -3 продуцирует моноклональное антителокласса (фиг.2). Пример 3. При исследовании специфичности-3 в непрямом ИФА в качестве гетерологичного антигена используют стафилококковый энтеротоксин (СЭА, производства НИВС, УФА). В качестве отрицательного контроля используют ячейки с блокирующим белком, без антигена. Данные эксперимента свидетельствуют о высокой специфичности МКА, вырабатываемого штаммом -3 к нативной молекулезолотистого стафилококка (фиг.3). Полученная гибридома,синтезирующая высокоспецифичные моноклональные антитела с высоким титром против нативной молекулыпо своим характеристикам превосходит известные. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм гибридных культивируемых клеток животных . .3 (Криобанк Института молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина, регистрационный номер 2) продуцент моноклональных антител к стафилококковому альфа-токсину .