Способ получения пробиотической кормовой добавки для профилактики желудочно-кишечных заболеваний у животных

(51) 23 1/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ добавки,используемой для профилактики желудочно-кишечных заболеваний у животных. Для решения указанной задачи предлагается способ получения пробиотической кормовой добавки предназначенной для профилактики желудочно-кишечных заболеваний животных,включающий культивирование штаммов Вас.и Вас. , концентрирование биомасс клеток бактерий, смешивание концентратов с протектором микробных клеток и последующее стерильное высушивание, при этом используют штамм Вас.17 и штамм Вас.356, биомассы штаммов смешивают в соотношении 11, в качестве протектора микробных клеток используют хлорид натрия в количестве,обеспечивающем титр клеток в готовом продукте после сушки не менее 11011 КОЕ/г. Техническим результатом данного изобретения является повышение эффективности пробиотической составляющей получаемого продукта,что обеспечивает благоприятную коррекцию микрофлоры кишечника животных и птицы, что приводит к привесам животных.(72) Раманкулов Ерлан Мирхайдарович Балпанов Дархан Серикович Тен Олег Андреевич Сураганова Динара Аскаровна Жусупов Серик Искакович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОЙ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ЖЕЛУДОЧНОКИШЕЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У ЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относится к биотехнологии,ветеринарии и может быть использовано для получения пробиотического препарата для профилактики желудочно-кишечных заболеваний животных. Задачей предлагаемых изобретений является разработка высокоэффективной пробиотической Изобретение относится к биотехнологии,ветеринарии и может быть использовано для получения пробиотической кормовой добавки для профилактики желудочно-кишечных заболеваний животных. Способ получения пробиотической кормовой добавки на основе спорообразующих штаммовипредусматривает культивирование штаммов,концентрирование, смешивание биомасс клеток бактерий с протектором микробных клеток и последующее высушивание. При этом в способе используют штамм Вас.17 и штамм Вас.356. Биомассы штаммов смешивают в соотношении 11. В качестве протектора микробных клеток используют хлорид натрия в количестве,обеспечивающем титр клеток в готовом продукте после сушки не менее 11011 КОЕ/г. Способ позволяет получить препарат,обладающий широким спектром действия и который может быть использован для профилактики желудочнокишечных заболеваний животных и птицы. Создание пробиотических кормовых добавок комплексного действия,обладающих антимикробной,иммуномодулирующей активностью, является актуальной задачей для медицины и ветеринарии. В состав пробиотиков могут входить один бактериальный штамм, но чаще всего используются комплексные препараты,состоящие из несколько штаммов бактерий разного вида в различных комбинациях. Одним из примеров таких комплексных препаратов являются препараты на основе спорообразующих бактерийи, имеющих различные потребности в кислороде,что позволяет пролонгировать действие препарата и осуществлять специфическую активность не только в аэробных отделах желудочно-кишечного тракта, но и в анаэробных. Известны ряд способов получения препаратов на основе спорообразующих бактерийиИзвестен бактериальный лечебнопрофилактический препарат, включающий биомассу бактерий Вас.5/6, биомассу бактерий Вас.2/10 и биомассу бактерий Вас.31 (А.с. СССР 1398868, МКИ А 61 35/74, опубл. 1988 г.). Смесь указанных компонентов препарата представляет собой микробную ассоциацию при объемном их соотношении 111 (содержание каждого компонента препарата 100-150 млрд. микробных клеток в 1 мл физраствора). Указанную жидкую форму препарата используют для лечения гнойно-септических послеродовых заболеваний. Препарат имеет широкий спектр антагонистической активности. Недостатком данного препарата является то, что он имеет жидкую форму, которая долго не хранится и не удобна в применении. Известен пробиотический препарат комплексного действия,обладающий антибактериальной активностью и способ его получения на основе биомассы штамма Вас.ВКПМ В-4759 и штамма Вас.2336/105,2 характеризующийся смешиванием живой биомассы указанных штаммов со стабилизатором при титре клеток соответственно 1107-1109 и 1108-10109. Препарат одновременно обладает антибактериальной и антивирусной активностями и успешно применяется в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (Патент РФ 2159625, кл. А 61 35/66, опубл. 27.11.2000). Недостатком данного препарата является использование рекомбинантных штаммов,содержащих плазмиду,детерминирующую устойчивость к антибиотикам. Известен способ получения пробиотического препарата, заключающийся в смешивании биомассы бактерийВ-2250 и/илиВ-2252 и вспомогательных веществ носителя-сорбента и влагоемкого наполнителя. В качестве носителя- сорбента она содержит аэросил гидрофильный марки А и гидрофобный марки ,влагоемкого наполнителя - смолы-катиониты ионообменные марок КБ-4 П-2 и КУ-2-8 чс в заданном соотношении компонентов по массе сухого вещества. Сухую микрокапсулированную форму пробиотической добавки получают методом капиллярно-сорбционного высушивания смеси компонентов до содержания влаги в готовом продукте 8-25. В результате получают микрокапсулированную форму пробиотической добавки, содержащую пробиотик, удобную в применении и употреблении,способную обеспечивать стабильность свойств на всех этапах приготовления ( 2252956 С 2, кл. 12 1/20,А 23 1/165, А 61 35/66, 26 5/16, 12 1/20,12 107, 2005). Однако полученный вышеуказанным способом пробиотический препарат недостаточно эффективен в отношении коррекции микрофлоры кишечника в связи с невысоким содержанием пробиотических микроорганизмов. Кроме того, его производство энергозатратно и сложно. Отмеченные недостатки обуславливают актуальность и целесообразность разработки высокоэффективной пробиотической добавки,используемой для профилактики желудочнокишечных заболеваний у животных. Задачей предлагаемых изобретений является разработка высокоэффективной пробиотической добавки,используемой для профилактики желудочно-кишечных заболеваний у животных. Для решения указанной задачи предлагается способ получения пробиотической кормовой добавки предназначенной для профилактики желудочно-кишечных заболеваний животных,включающий культивирование штаммов Вас.и Вас. , концентрирование биомасс клеток бактерий, смешивание концентратов с протектором микробных клеток и последующее стерильное высушивание, при этом используют штамм Вас.17 и штамм Вас.356, биомассы штаммов смешивают в соотношении 11, в качестве протектора микробных клеток используют хлорид натрия в количестве, 29093 формы, одиночные или в цепи из 2-х, 3-х или более клеток. Споры цилиндрические или эллипсовидные. Культуральные признаки на плотной среде МПА культура формирует округлые плоские колонии,матовые с ровным или слегка извилистым краем,3-5 мм в диаметре. Физиолого-биохимические признаки факультативный анаэроб, оптимальная температура роста 37 С и 7,0. Продуцирует каталазу. Гидролизует крахмал, желатину, пептонизирует молоко. Не обладает лецитиназной,коагулазной,гиалуронидазной активностью. Штамм не является патогенным для животных и человека. Способ осуществляют следующим образом биомассу Вас.17 и Вас.356 получают путем культивирования в качалочных колбах или в ферментационных аппаратах на пептонно-дрожжевой среде и среде с соевой мукой в стерильных условиях, отделяют биомассу на центрифуге, пасту смешивают с протектором хлоридом натрия и высушивают в распылительной сушке, фасуют. Изобретение поясняется примерами. Пример 1. Антагонистическая активность Оценку антагонистической активности проводили методом агаровых блоков. В качестве тест-организмов использовали типичных представителей грамотрицательной и грамположительной микрофлоры - культуры 113-3 и 209 Р соответственно. Поверхность питательной среды МПА засевали сплошным газоном культуры Вас.17 или Вас.356. Через 48 часов на поверхности среды образовывался сплошной слой биомассы. Полученную культуру на плотной питательной среде инактивировали хлороформом в течение 30 минут. Стерильным пробочным сверлом вырезали агаровые блоки из питательной среды с инактивированной культурой и переносили их на поверхность другой агаровой пластинки в чашке Петри, предварительно засеянной тест-организмом. После инкубации в термостате в течение 24 часов вокруг агаровых блоков образовывались зоны отсутствия роста тест-организма. По диаметру зон просветления судили об антагонистической активности микроорганизма. Таблица Результаты оценки антагонистической активности Вас.17 Вас.356 обеспечивающем титр клеток в готовом продукте после сушки не менее 11011 КОЕ/г. Техническим результатом данного изобретения является повышение эффективности пробиотической составляющей получаемого продукта,что обеспечивает благоприятную коррекцию микрофлоры кишечника животных и птицы, что приводит к привесам животных. В способе производства используются следующие штаммы бактерий- штамм бактерий 17,депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ГНИИ Генетика под номером ВКПМ В-4828. Штамм выделен из содержимого толстого отдела кишечника здорового теленка. Штамм устойчив к воздействию пенициллина (1 ед/мл). Обладает антагонистической активностью против грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.- штамм бактерий 356,депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ГНИИ Генетика под номером ВКПМ В-3148. Штамм получен селекционным путем. Штамм является продуцентом антибиотика бацитрацин. Характеристика штамма Вас.17. Культурально-морфологические признаки. Палочки. Величина клеток односуточной агаровой культуры 2-30,5 мкм. Клетки окрашиваются положительно по Грамму, образуют споры,центральные, диаметр меньше диаметра клетки. Колонии на МПА телесного цвета, пигмент в среду не выделяют. Физиолого-биохимические признаки Аэроб,оптимальная температура роста 37 С и 7,0. Продуцирует каталазу. Культура ферментирует глюкозу, мальтозу, лактозу, маннит, сахарозу с образованием кислоты без газа. Гидролизует крахмал, желатину, не гидролизует мочевину,утилизирует цитрат. Не обладает лецитиназной,коагулазной,гиалуронидазной активностью. Штамм не является патогенным для животных и человека. Характеристика штамма Вас.356. Культура представляет собой грамположительные аэробные спорообразующие палочки размером 3-4,50,8-1,5 мкм. Палочки неподвижные, цилиндрической или эллипсовидной Пример 2. Приготовление жидких питательных сред для ферментации. Состав питательной среды для 17(пептонно-дрожжевая среда), г/л дрожжевой экстракт - 5,0, пептон - 15,0,натрия хлорид - 5,0,вода водопроводная - до 1 л Состав питательной среды для 356 (среда с соевой мукой), г/л соевая мука 25,0,3 Для получения инокулята в качалочную колбу объемом 750 мл с жидкой питательной средой объемом 100 мл вносили 0,5-1 мл споровой взвеси,смытой с пробирки 10 мл физиологического раствора. Выращивание проводили в термостатируемой качалке при 180-240 об/мин. Культивирование Культивирование проводили при 37 С в ферментационных аппаратах вместимостью 10 л и 130 л. Режим культивирования для 17 скорость перемешивания 350 мин-1, аэрация 1,5 л/л среды в мин для 356 скорость перемешивания 250 мин-1, аэрация 1,0 л/л среды в мин. Культивирование проводили до обильного спорообразования (90-100 спор). Количество бактерий определяли методом десятикратных разведений с высевом на чашки Петри. Таблица Результаты культивирования крахмал картофельный - 20,0,магний сернокислый - 3,0,кальций углекислый - 10,0,вода водопроводная - до 1 лсред 7,50,1 доводят 20 растворомдо 7,30,2. Стерилизуют при температуре 1211 С в течение 20-30 мин. Получение инокулята Культуру бактерий Вас.17 и Вас.356 хранят на скошенной плотной среде МПА в пробирках, закрытых ватномарлевыми пробками при температуре 4-6 С. Для поддержания культуры в жизнеспособном состоянии один раз в 6 мес производят пересев на свежую питательную среду МПА и выращивают при 37 С в течение 16-24 ч до спорообразования. Концентрирование и сушка полученной культуральной жидкости Концентрирование культуральной жидкости проводили центрифугированием. Для этого полученные культуральные жидкости Вас.17 и Вас.356 смешивали по титру в соотношении 11. Центрифугирование проводили на центрифуге 6 при 6000-7000 об/мин, в течение 25 мин. Пасту бактерий Вас.17 и Вас.356 выгружают в пластиковые емкости. Смешивали с 1 раствором хлорида натрия (протектор) в соотношении 1 часть пасты к 3 частям раствора. Далее провели распылительную сушку концентратов на распылительной сушилке-5 при температуре 140 С на входе и 80 С на выходе. Количество жизнеспособных бактерий в порошке составило 1,0-1,51011 КОЕ/г. Пример 3. Для определения пробиотической эффективности кормовой добавки взяты 2 группы мышей(10 особей) с выраженными изменениями состава кишечной микрофлоры вследствие антибиотикоассоциированного дисбактериоза (гентамицин). Животных рассаживали в индивидуальные кюветы. Одной группе животных вводили перорально суспензию кормовой добавки ежедневно двукратно в течение 7 суток. Другая группа животных контроль. У животных обеих групп в начале эксперимента и на 7 сутки введения препаратов отбирали фекальные массы для определения общего количества микроорганизмов,а также бифидобактерий, лактобактерий и эшерихий на 1 г фекалий (КОЕ/г). Таблица Результаты эффективности Микроорганизмы общее микробное число. бифидобактерии лактобактерии эшерихии Полученные результаты свидетельствуют о восстановлении нормальной микрофлоры кишечника у мышей с антибиотикоассоциированным дисбактериозом при пероральном ведении пробиотической кормовой добавки. Титр клеток, КОЕ/г Через 7 суток после Через 7 суток без введения введения пробиотика пробиотика (контроль) 6,90,5107 6,80,6105 6 6,60,410 0,0 1,8 0,1106 1,40,1104 7,80,5105 3,70,4104 5 3,1 0,210 1,5 0,1103 Полученные данные факты говорят о перспективности использования пробиотической кормовой добавки для профилактики желудочнокишечных заболеваний животных. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения пробиотической кормовой добавки для профилактики желудочно-кишечных заболеваний у животных,включающий культивирование штаммов, концентрирование,смешивание биомассы клеток бактерий с протектором микробных клеток и последующее стерильное высушивание, отличающийся тем, что используют штамм ы Вас 17 и Вас 356, биомассы штаммов смешивают в соотношении 11, в качестве протектора микробных клеток используют хлорид натрия в количестве,обеспечивающем титр клеток в готовом продукте после сушки не менее 11011 КОЕ/г.