Способ регенерации кожного покрова с использованием клеточного препарата “Фиброспрей”

(51) 61 9/12 (2006.01) 61 35/36 (2006.01) 61 17/02 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ использованием аллогенного или аутологичного клеточного материала для ускорения процесса заживления донорских и ожоговых ран. Поставленная цель достигается тем, клеточный материал, представляющий собой суспензию живых культивированных фибробластов в количестве 2050103 клеток на 1 см 2 в питательной среде без добавления ксеногенной сыворотки, наносится на раневую поверхность в виде аэрозоля как самостоятельно, так в комплексном хирургическом лечении. В качестве аллогенного материала рекомендуется использование штамма диплоидных эмбриональных фибробластов человека ФЭЧ 2/09(Инновационный патент 25091 от 15.12.2011),либо других аллогенных клеток, протестированных на биологическую безопасность. Клиническая эффективность применения способа регенерации кожного покрова с использованием клеточной культуры в виде аэрозоля - Фиброспрей проявляется за счет неспецифической стимуляции репарации эпителия,в основном, за счет выделения привнесенными клетками в раневую поверхность факторов роста,цитокинов и молекул межклеточного матрикса,ускоряющих заживление. Предложенный способ обеспечивает увеличение полноты приживления аутотрансплантатов, ускорение эпителизации ячеек перфорации и уменьшение сроков восстановления как основной, так и донорской раневых поверхностей.(72) Данлыбаева Газиза Аятбековна Абугалиев Кабылбек Ризабекович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ КОЖНОГО ПОКРОВА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КЛЕТОЧНОГО ПРЕПАРАТА ФИБРОСПРЕЙ(57) Изобретение относится к регенеративной,экспериментальной и клинической медицине,комбустиологии, трансплантологии, косметологии,и может быть использовано для восстановления кожных дефектов различной площади и глубины и корректировки функций поврежденных тканей путем трансплантации клеток из здоровых тканей,выращенных в условияхи сохраняющих свои физиологические функции при соответствующих условиях культивирования. Технической задачей изобретения является разработка способа восстановления кожного покрова при ожоговых поражениях с Изобретение относится к регенеративной,экспериментальной и клинической медицине,комбустиологии, трансплантологии, косметологии, и может быть использовано для восстановления кожных дефектов различной площади и глубины и корректировки функций поврежденных тканей путем трансплантации клеток из здоровых тканей,выращенных в условияхи сохраняющих свои физиологические функции при соответствующих условиях культивирования. Несмотря на свои многочисленные полезные свойства и различные функции, кожа является органом, который больше других подвержен действию неблагоприятных эндогенных и экзогенных факторов. На кожу человека влияют такие факторы, как яды и токсины, употребляемые в процессе жизнедеятельности и окружающая среда. Кроме того,выполняя множество функций,таких как теплорегуляция, выделение секретов, дыхание (обмен газов), депо энергетических запасов, кожа часто страдает от тех или иных внешних воздействий. Восстановление целостности кожи имеет решающее значение и может быть достигнуто различными способами, в том числе пересадкой кожи. Показаниями для пересадки кожи являются содействие ускоренному заживлению ожогов и других ран, снижение рубцовой контрактуры, улучшение косметического вида сформировавшихся рубцов,снижение потери жидкости, а также защита от патогенных микроорганизмов. Формирование и регенерация тканей, осуществляемые путем миграции клеток извне, являются основой одного из разделов регенеративной медицины - клеточной терапии. В настоящее время для клеточной терапии ожогов используют два типа клеток - фибробласты и кератиноциты. Для этого на первом этапе получают культуру фибробластов или кератиноцитов человека путем фрагментации и ферментной обработки дермы плодов человека. После получения первичной культуры изготавливают трансплантаты путем культивирования клеток на подсадочных материалах(Наука практике. Материалы научной сессии ЦНИИС. М., 1998, с.164-166). Известны различные способы восстановления кожного покрова. Одним из них является способ восстановления кожного покрова, заключающийся в трансплантации многослойного клеточного пласта аутологичных кератиноцитов на рану ( , . .,С.. // . . . . -1984- . 311, 8-488451). Известен способ восстановления кожного покрова посредством сложного комплекса, состоящего из синтетической подложки из коллагена, на которой находится пласт аутологичных кератиноцитов (Патент США 88/08303, кл. А 61 37/00). Общими недостатками указанных способов являются сложность и трудоемкость технологии, сравнительно низкая эффективность и высокая стоимость. Известны способы применения слоя клеточных культур на поверхности коллагенового и фибринового геля .- 1991, Н.- 1994, . Корр 1995. После формирования пластов гель с клетками 2 переносится на раневую поверхность. Н.трансплантировал аутологичные кератиноциты,выращенные на поверхности фибринового матрикса и поверх них накладывали расщепленные лоскуты аллокожи,консервированной в глицерине. Недостатком этих способов является дороговизна фибриновой и коллагенового гелей, неспособность клеток распластываться и расти в геле, трудность использования в широкой клинической практике. Известен также способ восстановления кожного покрова, включающий выращивание в искусственных условиях многослойных пластов кератиноцитов на поверхности культурального флакона, при этом для снятия клеточного пласта добавляют фермент диспазу и пересадку клеточной культуры на раневую поверхность осуществляют на поверхности парафинизированной марли см... . - 1979. - . 76.. 5665-5668. Такой способ стимулирует регенерацию собственного эпителия биологически активными веществами(факторы роста, цитокины и др.), которые выделяются клетками во внешнюю среду, при этом временно приживший трансплантат активно вытесняется и замещается собственным эпителием ( . .. -. //,. , 4, . 1998, . 212216). Однако способ имеет недостатки - сложность в осуществлении, так как состоит из большого числа этапов и высокая стоимость, которая складывается из затрат на большое количество одноразовой культуральной посуды,изготавливаемой из специальных видов пластика, а также из стоимости сред, сыворотки, ростовых факторов, ферментов. Известны случаи применения для лечения ожогов таких пленок, как Биокол Алейник Д.Я., Аминев В.А., Чарыкова И.Н., Кувакина Н.А. Использование современных биотехнологий для лечения поверхностных ожогов у детей младшего возраста // МатериалыМеждународного симпозиума Новые методы лечения ожогов с использованием культивированных клеток кожи. Саратов, 1998, с.6-8,Карбоксил-П Патент 02373944, от 23.06.2008,опубл. 27.11.2009, МПК А 61 33/00, Фолидерм Патент 2148970 С 1, опубл. 20.05.2000, Парамонов Б.А., Порембский О.Я., Яблонский В.Г. Ожоги. Руководство для врачей. Описан также каркас,состоящий из синтетических полимеров,предназначенный для регулирования клеточного роста и пролиферации, и фибробластов, после прикрепления которых к матриксу и начала роста,трансплантируемый пациенту (., Патенты США 5759830 5770193 5736372). При пересадке на рану прикладывался слой с культивированными клетками к ране, а плнка оказывалась на поверхности раны и выполняла защиту пересаженных клеток от высыхания. Известен способ применения, разработанный М.Эйсенберг ,91/160100 от 31.10.91,опубл. 27.08.1999 композиционного эквивалента живой кожи, состоящего из беспористого бычьего коллагена 1 типа, инокулированного аллогенными или аутологичными фибробластами и кератиноцитами, с последующим их культивированием в питательной среде с добавлением эпидермального фактора роста,инсулина и гидрокортизона. Известен способ восстановления кожного покрова при обширных ожогах, включающий выделение и культивирование кератиноцитов на коллагеновых микроносителях в течение 1-7 дней, после чего суспензию микроносителей с прикрепленными к ним кератиноцитами наносят на раневую поверхность Патент РФ 2010028 по кл. С 12 5/00, опубликован 30.04.94 г Известен способ восстановления ожогов 2 степени или в сочетании с аутодермопластикой для лечения глубоких и обширных поражений, а также широкого спектра ран, включая пластические, восстановительные, ожоговые и косметические, предложенный компанией. Препаратиз аутологичных кератиноцитов этой компании первоначально применялся для лечения незначительных до 2 поражения общей площади поверхности тела, затем был успешно применен для ран более 75 . Метод трансплантации культивированных аллогенных эпителиальных клеток успешно применяется не только в клинической комбустологии,но и лечении хронических трофических язв и свищей(Сергиенко Н.Ф. и др. Лечение мочевых свищей с применением культуры аллогенных фибробластов.//Урология, 1999, 1, с.44-46 Методические рекомендации Восстановление кожных покровов у тяжелообожженных больных с помощью пересадки выращенных эпидермальных пластов//Главное военно-медицинское управление МО РФ, Москва,1997, с. 10). По данным различных авторов приживление трансплантата аллогенных клеток наступает в 50-90 случаев. Пересаженные клетки оказывают многофункциональное влияние на процессы заживления раны,предотвращая негативное воздействие факторов внешней среды на глубжележащие ткани, выделяя различные клеточные медиаторы стимуляции регенерации, участвуют в синтезе базальных мембран. В результате происходит восстановление типичного для данной ткани эпителия(по пути физиологической эпителизации). Этот процесс носит гистотипический характер. Наиболее близкими к заявленному по технической сущности является способ восстановления кожного покрова у тяжелообожженных посредством трансплантации культуры аутологичных кератиноцитов в виде суспензии клеток ( Н.,А.,Т...- 1989. - . 15, . 5- 335-337) и способ трансплантации на ожоговые раны аллогенных фибробластов, выращенных на чашках Петри или специальных флаконах Институт хирургии им. А.В.Вишневского, Федоров В.Д. и др. 93002420/14 от 13.01.1993 публ. 30.11.1994. Недостатком этих способов является трансплантация клеток в виде клеточной суспензии,которую раскапывают на рану. Во время операции трансплантация жидкой клеточной культуры доставляет неудобства (стекание, впитывание в повязки, недостаточный визуальный контроль,неравномерность нанесения). При использовании кератиноцитов, многоэтапная процедура выращивания и подготовки эпидермальных кератиноцитов, большие количества дорогостоящих импортных реактивов,сред, сывороток, неравномерное распределение взвеси кератиноцитов по поверхности ран и невозможность визуального контроля распределения клеток, низкая эффективность заживления и высокая стоимость лечения усложняют процесс. Метод требует идеального состояния раны перед трансплантацией,что в определенной степени ограничивает возможности (временные) по пластическому закрытию ран. Ближайшими аналогами предлагаемого изобретения являются способы, предложенные д-ром Й. Герлахом из Института регенеративной медициныпри Университете Питтсбурга, называемый( 02/02/11) и метод 20110311497. Идея распыления клеток на ожоговую поверхность была предложена в 2002 году доктором Ф. Вуд ( ) из Австралии. Ее изобретение представляет собой ручной пульверизатор, предназначенный для распыления выращенных в лаборатории клеток кожи. При применении данного метода суспензию клеток получают из аутологичных, т.е. из собственных тканей, которые отбирают, подвергают обработке ферментами, подобными трипсину, для диссоциации клеток. Затем клетки, пригодные для пересадки фильтруют, фермент удаляют, помещают в питательную среду без ксеногенной сыворотки и наносят обратно пациенту устройством, в виде шприца с насадкой для распыления.ип представляет собой пневматическое устройство, с контролируемым процессором, которое не травмирует клетки во время распыления на поврежденную кожу. Пока устройство все еще находится на ранней стадии прототипа Герлахом был успешно пролечено около десятка пациентов в Германии и США, но окончательный вариант будет готов через несколько месяцев, так что он может быть проверен в клинических испытаниях. В течение процедуры у пациента берут биопсию здорового участка кожи, выделяют из нее стволовые клетки, водную суспензию которых распыляют на зону ожога. После этого раневую поверхность покрывают специальным образом разработанной повязкой, которую пронизывают две трубки, одна из которых выполняет роль артерии, а вторая - вены. Эти трубки обеспечивают доставку к ране электролитов,антибиотиков, аминокислот и глюкозы и выведение продуктов жизнедеятельности. Такая повязка обеспечивает стерильность раны и способствует формированию новой кожи. Однако предлагаемые авторами устройства сложны в использовании. Технической задачей данного изобретения является разработка способа регенерации кожного покрова при повреждениях с использованием клеточного 3 материала для ускорения процесса заживления донорских и ожоговых ран как самостоятельно, так в комплексном хирургическом лечении. Результатом предлагаемого изобретения является улучшение функциональной и репаративной активности кожи при ее патологии различного генеза,в том числе и ожогов различной степени. Повышение эффективности способа восстановления кожного покрова без грубых рубцов и контрактур,существенное сокращение пребывания больного с глубокими и обширными ожогами в клинике, и соответственно,снижение стоимости лечения обеспечивается достижением технического результата и является отличительным признаком заявляемого технического решения, что соответствует критерию изобретательский уровень. Технический результат достигается за счет трансплантации культивированных клеток кожи, как аллогенных (возможно использование штамма диплоидных эмбриональных фибробластов человека ФЭЧ 2/09 для регенеративной медицины инновационный патент 25091 от 15.12.2011), так и аутологичных, в количестве 20-50103 клеток на 1 см 2 на раневую поверхность в питательной среде без добавления ксеногенной сыворотки. Клиническая эффективность применения клеточной культуры в виде аэрозоля, мы его назвали Фиброспрей, проявляется за счет неспецифической стимуляции репарации эпителия, в основном, за счет выделения привнесенными клетками в раневую поверхность факторов роста, цитокинов и молекул межклеточного матрикса, ускоряющих заживление как ожоговых, так и донорских ран. Изобретение осуществляется следующим образом. Пример 1. Для получения аллогенных фибробластов восстанавливают клетки,ранее протестированные на биологическую безопасность и замороженные жидком азоте. Для этого ампулу с замороженными клетками оттаивают, вскрывают в стерильных условиях, суспензию переносят в культуральный флакон,добавляют полную питательную среду ДМЕМ с 10 ЭТС и инкубируют при температуре 37 С и в атмосфере 5 СО 2. Для наработки необходимого количества клеток проводят последовательные пассажи с коэффициентом рассева 12. При ожогахА степени, донорских и длительно незаживающих ранах трансплантацию 3-4 х дневной культуры аллофибробластов осуществляют непосредственно на подготовленные в результате комплексного лечения раны. При глубоких ожогах- степени трансплантацию аллофибробластов сочетают с аутодермопластикой с коэффициентом расширения 14 и более. Пример 2. Для получения аутологичных клеток кожно-мышечную ткань получают из донорского участка, помещают в раствор Хэнкса с антибиотиками(пенициллин и стрептомицин по 500 Ед/мл) и доставляют в лабораторию. Кожно-мышечную ткань, с соблюдением правил асептики механически очищают от мелких кровеносных сосудов, тщательно отмывают от эритроцитов в растворе Хэнкса с добавлением антибиотиков, измельчают и помещают в теплую 4 смесь 0,25-ного раствора трипсина и 0,02 раствора Версена при температуре 37 С на 30 минут. По истечении времени фермент сливают. Во флакон с тканью помещают стерильный стержень-магнит,наливают солевой раствор и помещают флакон на магнитную мешалку. Проводят 3 цикла дезагрегации по 5 минут со сменой среды, полученную взвесь после каждого цикла сливают, куда добавляют по 2-3 мл сыворотки для инактивации остатков фермента, затем все 3 пула объединяют, фильтруют и центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют в питательной среде ДМЕМ с антибиотиками. Подсчитывают количество жизнеспособных клеток. Суспензию клеток разводят до концентрации 3-4105 клеток в 1 мл питательной средой ДМЕМ с добавлением 10 сыворотки крови плодов коровы и переносят во флаконы для культивирования. Клетки культивируют при температуре 37 С. Пример 3. После наработки достаточного числа фибробластов,питательная среда замещается бессывороточной средой после чего клетки инкубируются не менее 6 часов, желательно более 12 часов при 37 С. Инкубация клеток в свободной от сыворотки среде в значительной степени удаляет из клеток белки фетальной телячьей сыворотки, которые могут вызвать аллергенную реакцию. После инкубации в бессывороточной среде клетки снимаются с культуральной посуды с помощью подогретой до 37 С смесью раствора Версена (0,02) и трипсина (0,25) в соотношении 11 в количестве,необходимом чтобы покрыть весь клеточный монослой и помещаются в термостат при 37 на 3-5 мин. После округления клеток в результате действия трипсин-Версена их разбавляют необходимым количеством среды ДМЕМ и слегка пипетируют для получения суспензии из одиночных клеток. Клетки подсчитывают,разводят до необходимой концентрации питательной средой без добавления ксеногенной сыворотки. Пример 4. Для трансплантации на раневую поверхность используют суспензию в концентрации 20-50103 клеток на 1 см 2. Готовую суспензию клеток помещают в стерильный флакон с прозрачным диспенсером (баллоном) для распыления в виде аэрозоля с перпендикулярным распылителем как на фиг.1. Пораженные участки кожи орошают струей аэрозоля, держа флакон в вертикальном положении либо немного наклонив, на расстоянии около 20-25 см от поверхности кожи, мягко и без усилия нажимая на крышку флакона. Распыление из такого флакона не повреждает клетки, а размер клеток позволяет им проходить через отверстие в штоке клапана. Индекс пролиферации клеток, посеянных из аэрозольного баллона равен 1,61,8, что сопоставимо с индексом пролиферации клеток в контроле, выращенных в культуральном флаконе(2,0-2,4). Благодаря нанесению суспензии тонким слоем на пораженный участок поверхности тела,происходит быстрое всасывание жидкой фазы и клетки абсорбируются на всей обработанной площади,поэтому терапевтический эффект наступает быстрее. К тому же, применение препарата в виде аэрозоля позволяет в течение короткого промежутка времени обработать достаточно большую поверхность. При использовании клеток в виде аэрозоля или спрея до и после наложения аутотрансплантатов(между перфорированными и пересаженными лоскутами) и на донорские участки было установлено, что после трансплантации клеток через 15-20 минут поверхность раны покрывается тонкой блестящей пленкой и истечение плазмы прекращается. Пример 5. Использование аллогенных диплоидных клеток человека для лечения ожогов. Больной Р. 38 лет, поступил в ожоговое отделение Республиканского Центра неотложной медицинской помощи с термическим ожогом А Б- степени головы, шеи,грудной клетки, брюшной стенки, поясничной области, верхних и нижних конечностей, площадь глубоких ожогов составила 60 поверхности тела. Проводилась комплексная медикаментозная терапия тяжелого течения ожоговой болезни. Для подготовки ожоговой раны к кожной пластике проводился химионекролизис салициловой мазью 40 и этапные некрэктомии. После очищения ожоговых ран, клинической готовности к восприятию кожных трансплантатов начаты этапные аутодермопластики. Всего выполнены 4 операции по трансплантации расщеплнной аутокожи. Комбинированная трансплантация аутокожи и аллотрансплантация диплоидных клеток кожно-мышечной ткани человека ФЭЧ 2/09 выполнена на 14 и 56 сутки. Нанесение суспензии фибробластов проводилось за 30 минут до аутодермопластики методом аэрозольного распыления. При комбинированной аутодермопластике коэффициент перфорации кожи был 16. После трансплантации аутокожи взвесь фибробластов в виде аэрозоля наносилась и на ячейки перфорации. Было отмечено,что нанесение суспензии клеток улучшает адгезию аутотрансплантата. Первая перевязка проведена на 6 сутки. Приживление трансплантатов в обеих операциях по вербально-числовой шкале приживления трансплантата расценено как оптимальное - 0,8. При последующих перевязках отмечено ускоренная эпителизация ячеек перфорации, активная краевая эпителизация ранее пересаженных трансплантатов. Больной выписан на 77 день с момента поступления в клинику с зажившими ожоговыми ранами. Таким образом,комбинированная аллотрансплантация диплоидных аллофибробластов и аутокожи привело к увеличению полноты приживления аутотрансплантатов,ускорению эпителизации ячеек перфорации и уменьшению сроков восстановления кожных покровов Полученные результаты свидетельствуют о возможности и перспективности применения предложенного способа для повышения качества и скорости заживления раны наряду с уменьшением продолжительности и степени выраженности воспалительных и инфекционных осложнений. Оптимизация способа восстановления раневой поверхности позволила добиться хороших косметических и функциональных результатов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ регенерации кожного покрова при обширных раневых поверхностях, длительно незаживающих ранах и трофических язвах,включающий выделение, культивирование и нанесение на раневую поверхность клеточного препарата, состоящего из аутологичных или аллогенных фибробластов, отличающийся тем, что для приготовления клеточного препарата используют аутологичные клетки кожи или аллогенный штамм диплоидной культуры эмбриональных фибробластов ФЭЧ 2/09 в виде аэрозоля Фиброспрей.