Способ диагностики бешенства

(51) 61 39/205 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Технический результат заключается в повышении эффективности и активности диагностического препарата. Способ диагностики бешенства постановкой иммуноферментного анализа путем нанесения исследуемого образца на нитроцеллюлозную мембрану с трехкратным последовательным ее контактированием с листами хроматографии бумаги, смоченными антирабической сывороткой в разведении 11600 в течение 30-60 минут,антивидовым конъюгатом в течение 30-60 минут,субстратом бензидином и визуальным учетом результатов по появлению четко окрашенных пятен. Разработанный метод диагностики бешенства позволяет обнаруживать антигены вируса в различных пробах и дифференцировать их от гетерологичных.(76) Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Хусаинов Дамир Микдатович Батанова Жанат Мухаметкалиевна Березин Владимир Элеазарович Богоявленский Андрей Павлинович Икранбегийн Риза Глебова Татьяна Ивановна(56) Селимов М., Гордиенко Е. Производство антирабического иммуноглобулина животного происхождения. Метод, используемы в СССР // Методы лабораторных исследований по бешенству. ВОЗ. Женева, 1975, с. 301-305(57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и иммунологии, в частности, к серологической диагностике бешенства. Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и иммунологии, в частности, к серологической диагностике бешенства. Известен способ диагностики бешенства путем определения наличия вируса бешенства в тканях животных иммуноглобулином антирабическим флуоресцирующим,с постановкой реакции иммунофлуоресценции. (М. В. Ваненков, Б. Л. Десятников. Диагностика и эпизоотология бешенства. // Ветеринария.-1, 1962.). Недостатком способа является недостаточная чувствительность и то, что данный способ не обеспечивает прижизненной диагностики бешенства. Известен также способ диагностики бешенства путем определения наличия вируса бешенства в тканях животных иммуноглобулином антирабическим преципитирующим,с постановкой реакции преципитации.(М.Селимов,Е.Гордиенко. Производство антирабического иммуноглобулина животного происхождения Метод, используемый в СССР // Методы лабораторных исследований по бешенству. ВОЗ.- Женева, 1975.- С. 301-305). Недостатком способа является то, данный способ также является недостаточно чувствительным и не обеспечивает прижизненной диагностики бешенства. Задачей изобретения является разработка высокочувствительного способа для прижизненной и посмертной диагностики бешенства. Технический результат заключается в повышении эффективности и активности диагностического препарата. Технический результат достигается путем иммунизации животныхпродуцентов вируссодержащей мозговой тканью, получением антирабической сыворотки,с последующей постановкой реакции иммуноферментного анализа на мембранном сорбенте. Сущность способа. На нитроцеллюлозную мембрану (НМ) диаметром 0,45 нмс помощью микропипетки наносят по 3-7 мкл исследуемого материала (взятого от подозреваемых в заражении бешенством животных, предположительно содержащего рабический антиген) в разведении 1100 и выше в 0,9 физиологическом растворе, после чего высушивают при комнатной температуре. Для удаления несвязавшегося белка мембрану далее отмывают физиологическим раствором и инкубируют в блокирующем растворе (1 БСА в 0,01 М трисбуферном растворе 7.4) в присутствии 0,05 детергента Твин-20 в течение 1 ч при 37 С. После этого НМ-у отмывают промывочным буферным раствором(ПБР), состоящим из в 0,01 трис- буферного раствора с 7,4, 0.05 Твина-20, 5 раз по 5 мин. Затем на НМ накладывают лист хроматографической бумаги,пропитанной полученной нами гипериммунной антирабической сывороткой, разведенной буферным раствором для сыворотки (10 цельной лошадиной сыворотки в 0,01 М трис буферном растворе 7.4,0,05 Твин-20) и инкубируют в течение 15-60 мин. После повторной отмывки ПБР 5 раз по 5 мин на пластину накладывают лист хроматографической бумаги, пропитанной конъюгатом антивидовых антител, меченных пероксидазой хрена, разведенного в 2 буферном растворе для сыворотки (1100-1400) и инкубируют в течении 30-60 мин 37 С, после чего иммуносорбент отмывают ПБР от несвязавшегося конъюгата. Реакцию проявляют путем обработки иммуносорбента раствором субстрата (0,03 бензидин в 0,01 М трис- буферном растворе 7.4) при окислении которого формируются нерастворимый хромогенный комплекс. При этом в качестве окислителя используют 0,003 раствор Н 2 О 2. Результат положительная реакция на антиген проявляется в виде четко окрашенных пятен на иммуносорбенте, отрицательная реакция на антиген не вызвает появление окрашенных пятен на иммуносорбенте. 1. Техника получения антигена Для получения вируссодержащей мозговой ткани используют ослят 1,5-2 - месячного возраста, матери которых не были вакцинированы против бешенства. Животных заражают интрацеребрально в дозе 0,1-0,2 см 2 1-ной суспензией вируса бешенства (штамм овечий ВГНКИ). Суспензию готовят в стерильных условиях из вируссодержащего головного мозга лабораторного животного, на котором пассируется фиксированный вирус бешенства. Ткань тщательно растирается в ступке пестиком и готовят 10 суспензию на 0,85 растворе хлорида натрия, добавляя антибиотики из расчета но 500 ЕД. пенициллина и стрептомицина на 1 мл. Далее гомогенат подвергается обработке ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут. Затем гидролизат центрифугируется при 3-5 тыс. оборотов 5-10 минут. Осадок суспендируется в 200 мл дистиллированной воды, повторной подвергается обработке ультразвуком до получения гомогенной суспензии (при 15-20 КГц в течение 25-30 минут). Ультразвуковой лизат фильтруется через ватномарлевый тампон (осадок удаляется). Далее вирус бешенства очищают центрифугированием при небольшой скорости (4000 ,15 мин) для удаления крупных посторонних частиц, а затем центрифугируют при высокой скорости (40 000 ,30 мин) для осаждения вирусных частиц. Осажденный вирус ресуспендируют в физиологическом растворе(добавляют объем, равный 1/10 объема элюата),центрифугируют при 2000 в течение 10 мин для удаления крупных частиц, и надосадочную жидкость наслаивают на сахарозный градиент. 12 мл концентрированной суспензии вируса наслаивают на 28 мл линейного градиента сахарозы (1040-ный раствор сахарозы, приготовленный на физиологическом растворе, забуференном 0,01 М -фосфатным буфером с 7,5) и центрифугируют при 15 000 об/мин в ультрацентрифуге , ротор 25, в течение 40 мин. Дно пробирки прокалывают и собирают фракции(по 2 мл), вытекающие из отверстия. Зона, содержащая вирус, располагается на границе верхней трети градиента. Ее легко обнаружить по опалесценции. В этой зоне должно содержаться около 65 вируса,наслоенного на градиент. (Концентрация вируса выражается в ГАЕ в 1 мл.) Вирус содержится также в более низких частях градиента, а кроме того, в осадке однако эти две фракции отбрасывают. Главную содержащую вирус фракцию разбавляют физиологическим раствором и центрифугируют при 40000 в течение 2 ч. Осажденный вирус представляет собой более или менее прозрачную, окрашенную в соломенный цвет массу. Его ресуспендируют в физиологическом растворе, содержащем 0,08 азида натрия. Полученную белую сильно опалесцирующую суспензию хранят при 4 С. Рабический антиген для иммунизации лошадей применяют в 2-х вариантах, основу которых составляет 4-ная суспензия вирулентного мозга жеребенка на физиологическом растворе хлорида натрия. Добавление к одной части суспензии 0.25 фенола образует фенольный антиген. Другой - адъювантдепонированный антиген содержит в своем составе 0,05 сапонина, 20 гидрата окиси алюминия и 0,1 формалина. 2 Техника иммунизации животных Для получения антирабической сыворотки отбирают клинически здоровых, упитанных лошадей, полученных из благополучных по инфекционным инвазионным заболеваниям хозяйств. Иммунизацию животных осуществляют подкожными и внутримышечными инъекциями рабических антигенов в области шеи и крупа. Объем вводимого материала делят на несколько порций и вводят в разные участки тела. Животных иммунизируют 4-8 кратно с интервалом 10- 20 дней в зависимости от варианта антигена с соблюдением правил асептики и антисептики. Вначале вводят адъювантдепонированный антиген в дозе 10 см 3,который повторяют ежемесячно. Фенольный антиген вводят каждые 2 недели в возрастающих дозах от 10 до 50 см 3. Нарастание титра антител проверяют в пробах сыворотки крови, взятой индивидуально от каждого животного в процессе иммунизации по тестам РДП и. На 10 день после последний инъекции антигена у лошадей осуществляют пробное крововзятие с забором крови из расчета 400 см 3 с 100 кг живой массы тела. При достижении преципитационного титра 1321128 через 21 день производится следующее крововзятие по полной производственной норме (1800 см 3 на 100 кг живой массы). Вируснейтрализующая активность такой сыворотки, определяемая методом титрования на белых мышах, соответствует 1000-2000 ЕР. Сыворотка изготавливается стерильно, сохраняется в условиях холодильника при температуре 4-6 С и в течение года используется для диагностических целей. 3. Постановка реакции На нитроцеллюлозную мембрану (НМ) диаметром 0,45 нмс помощью микропипетки наносят по 3-7 мкл исследуемого материала (взятого от подозреваемых в заражении бешенством животных,предположительно содержащего рабический антиген) в разведении 1100 и выше в 0,9 физиологическом растворе, после чего высушивают при комнатной температуре. Для удаления несвязавшегося белка мембрану далее отмывают физиологическим раствором и инкубируют в блокирующем растворе (1 БСА в 0,01 М трис- буферном растворе 7.4) в присутствии 0,05 детергента Твин-20 в течение 1 ч при 37 С. После этого НМ-у отмывали промывочным буферным раствором (ПБР), состоящим из в 0,01 трис буферного раствора с 7,4, 0.05 Твина-20, 5 раз по 5 мин. Затем на НМ накладывали лист хроматографической бумаги, пропитанной полученной нами гипериммунной антирабической сывороткой,разведенной буферным раствором для сыворотки (10 цельной лошадиной сыворотки в 0,01 М трис буферном растворе 7.4, 0,05 Твин-20) и инкубировали в течение 15-60 мин. После повторной отмывки ПБР 5 раз по 5 мин на пластину накладывали лист хроматографической бумаги, пропитанной конъюгатом антивидовых антител, меченных пероксидазой хрена,разведенного в буферном растворе для сыворотки(1100-1400) и инкубировали в течении 30-60 мин 37 С,после чего иммуносорбент отмывали ПБР от несвязавшегося конъюгата. Реакцию проявляли путем обработки иммуносорбента раствором субстрата (0,03 бензидин в 0,01 М трис- буферном растворе 7.4) при окислении которого формировался нерастворимый хромогенный комплекс. При этом в качестве окислителя использовали 0,003 раствор Н 2 О 2. Результат положительная реакция на антиген проявлялась в виде четко окрашенных пятен на иммуносорбенте, отрицательная реакция на антиген не вызвала появление окрашенных пятен на иммуносорбенте. 4. Эффективность способа В ходе разработки техники постановки иммуноферментного метода установлено,что максимальный титр антирабического сыворотки составлял 1102400 при концентрации рабического антигена -1 мкг/точка. Детекция минимального количества рабического антигена 0.0001 мкг/точка происходила при разведении антирабической сыворотки 1400-1800. Однако при разведении антирабической сыворотки 1400-1 800 появлялось неспецифическое связывание с антигенами нормальной лошадиной сыворотки в концентрации 1 мкг/точка. Таким образом,детекция специфического иммунного комплекса происходила при разведении антирабической сыворотки 11600-113200. Исходя из этого, за рабочую дозу антирабического сыворотки брали разведение сыворотки,позволяющее осуществлять детекцию рабического белка в концентрации 1 нг/ точка (Табл.1). Установлено, что через 3 минуты инкубации антигена с моноспецифической антирабической сыворотки на НМ начинали появляться комплексно антиген-антитело (Табл.2). Интенсивность окраски пятен возрастала к 60-ой минуте, далее оставалось на одном уровне. Влияние инкубации комплекса антиген-антитело с конъюгатом на эффективность проявление пятен изучали с помощью различных концентрации антигена вируса бешенства с антирабической сыворотки и нормальной лошадиной сывороткой в разведении 1600(Табл.2). При 30 минутой инкубации в 37 С, детекция белка составляла 0.01 мкг, а при 60 минутной -0.001 мкг/точка. Дальнейшее увеличение времени инкубации не влияло на чувствительность метода. Таблица 1 Определение рабочей дозы специфической антирабической сыворотки Разведение 1 Концентрация белка антигена вируса бешенства, мкг/точка Антирабическая сыворотка Нормальная сыворотка 0.1 0.01 0.001 0.000 1 0.1 0.01 0.001 Влияние времени инкубации рабического антигена с антирабической сывороткой на выявление комплекса антиген - антитело Время инкубации, мин Детекция рабического антигена в комплексе с антирабической сывороткой (11600) В положительном образце В отрицательном образце Влияние длительности инкубации иммунного комплекса с конъюгатом на количестве выявляемого антигена Время инкубации, мин Детекция рабического антигена в комплексе с антирабической сывороткой (11600) Положительные образцы мкг/точка Отрицательные образцы 5 15 30 0.01 60 0.001 120 0.001 Таблица 4 Результаты сравнительного изучения чувствительности антирабической сыворотки в МИФА, РДП и РИФ с фиксированным вирусом бешенства МИФА Разведение Количество белка антигена, мкг/точка сыворотки Положительный антиген Отрицательный антиген 1 110 1100 11000 110000 1 110 1100 11000 110000 1400 Реакция диффузной преципитации 110 1100 1200 1400 1800 110 1100 1200 1400 1800 18 Для изучения диагностической ценности разработанного метода, мы исследовали материал,полученный от инфицированных животных до появления клинических признаков болезни и материал(табл 5.), и подвергшийся разложению при 20-25 С в течение недели (табл 6.). По данным табл 5 разработанный нами ИФА в отличие от методов РДП и РИФ показал более высокую чувствительность. Наличие антигенов вируса бешенства обнаружена на 1-2 день после заражения, тогда как РДП и РИФ методами антиген вируса в биоматериалах диагностирован только на 7 сутки, т.е. только при появление клинических симптомов. Таблица 5 Результаты изучение сроков обнаружения антигенов вируса бешенства до появления клинических признаков болезни Время после инфицирования, сут Метод диагностики РДП РИФ МС ИФА 1 7 к к к Применение. - отрицательная бешенства. В пробах мозга вирусом бешенства выдерживали неделю при 20-25 С, антиген вируса бешенства методом ИФА зафиксирован в течение 6 суток. А методом РДП после первых двух суток,павших щенков, зараженных методом РИФ 3 сутки антиген вируса бешенства не(штамм Овечий), которых удалось. Таблица 6 Результаты обнаружения антигенов вируса бешенства в мозгу щенков,хранившихся при 20-25 С Время после Метод диагностики инфицирования,РДП РИФ МС ИФА сутки 1 Таким образом, разработанный нами метод для лабораторной диагностики бешенства позволяет обнаруживать антигены вируса и дифференцировать их от гетерологичных. Применяя данный метод диагноз можно поставить за 2-3 суток до появления клинических признаков болезни и в течение 6 сут. после гибели животных и при хранении материала при 20-25 С. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики бешенства путем определения наличия вируса бешенства в тканях животных,отличающийся тем, что диагностику осуществляют постановкой иммуноферментного анализа путем нанесения исследуемого образца на нитроцеллюлозную мембрану с трехкратным последовательным ее контактированием с листами хроматографии бумаги, смоченными антирабической сывороткой в разведении 11600 в течение 30-60 минут, антивидовым конъюгатом в течение 30-60 минут, субстратом бензидином и визуальным учетом результатов по появлению четко окрашенных пятен.