Способ серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота

(51) 01 33/53 (2011.01) 61 39/40 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к ветеринарии, а именно к диагностике лейкоза крупного рогатого скота. Технической задачей изобретения является повышение точности и эффективности детекции специфических антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота антител, которая решается за счет того,что сенсибилизация носителя(полистиролового планшета) проводится моноклональными антителами (МКА), которые фиксируют на своей поверхности специфичный полипептидный антиген р 24. Тестируемые специфические антитела связываются с антигеном р 24, с последующим выявлением образовавшегося комплекса с помощью антивидового пероксидазного конъюгата, активность которого проявляется хромогеном и оценивается с помощью спектрофотометра.(72) Боровиков Сергей Николаевич Булашев Айтбай Кабыкешович Сураншиев Жанболат Амреевич Куйбагаров Марат Амангельдыевич Киян Владимир Сергеевич(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(54) СПОСОБ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 25695 Изобретение относится к ветеринарии, а именно к диагностике инфекционных болезней животных. Лейкоз крупного рогатого скота (ЛКРС) диагностируют на основе клинических,серологических,гематологических и патологоанатомических данных. Однако,длительный инкубационный период (от двух до десяти лет), многообразие форм проявления болезни, стертая симптоматика, низкие титры антител в индивидуальных пробах сыворотки или в образцах, полученных из проб патологического материала затрудняют постановку диагноза этими методами. Поэтому в настоящее время все большее значение приобретают высокочувствительные иммунологические тесты диагностики, такие как иммуноферментный анализ (ИФА) основанные на применении специфических моноклональных антител, для выявления инфицированных и больных вирусом лейкоза КРС (Гулюкин М.И., Нахмансон В.М., Дун Е.А. Серологический метод диагностики в системе противолейкозных мероприятий.//Ветеринария, 7. - 1997). Для серологической диагностики, и обнаружения специфических антигенам ВЛКРС антител в настоящее время наиболее часто применяется реакция диффузной преципитации (РДП). Благодаря простоте, специфичности и достаточно высокой эффективности эта реакция получила наибольшее применение с гликопротеинным антигеном ВЛКРС. Из вируса,осажденного методом ультрацентрифугированая культуральной жидкости краткосрочных культур лейкоцитов лейкозных животных, очищенного в градиенте плотности сахарозы и обработанного эфиром, получают антиген, который используют в РДП. С помощью этого антигена в сыворотках крови инфицированных ВЛКРС животных выявляют антитела к внутреннему полипептиду вируса р 24. РДП с гликопротеидньгм АГ более чувствительный метод выявления инфицированных ВЛКРС животных, чем РДП с полипептидным антигеном (Авилов В.М. и др. Ветеринария, 1995). Не смотря на простоту постановки,чувствительность этого способа невысокая и не позволяет выявлять весь спектр специфических антител. В последние годы для диагностики ВЛКРСинфекции разработан и широко используется за рубежом метод иммуноферментного анализа (ИФА),основанный на применении антивидового конъюгата с использованием ферментов-маркеров. Метод ИФА обладает рядом значительных преимуществ более высокая, чем в РДП,чувствительность и специфичность, возможность автоматизации процесса и сокращения времени анализа. Кроме того, с помощью ИФА можно обнаружить антитела к ВЛКРС в моче и молоке( ,.. -.. .1993.). Имеются данные о разработке и успешном применении иммуноферментной тест-системы с использованием очищенного рекомбинантного гликопротеинного антигена 51 сотрудниками 2,,.(51)-., . 2004, . 147-151). Сотрудниками Северо-Кавказского зонального научноисследовательского ветеринарного института (г. Новочеркасск, РФ) разработан непрямой вариант иммуноферментного анализа сывороток крови КРС с использованием очищенного вирусного антигена полученного из культуры клеток почки эмбриона овцы . В результате проведенных исследований 3704 проб сывороток крови коров дойного стада из хозяйств Ростовской области обнаружено позитивно реагирующих в РИД -1917, что составляет 51 и при использовании ИФА - 2296 проб, что составляет 62 (Мальцева Н.А., Олийник Е.И., Молчанов В.П.,Баранов В.И, Животов А.А Иммунноферментная диагностика ВЛКРС-инфекции. Электронный журнал Исследовано В России. 2000 г.). Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту (прототипом) является способ определения специфических антител,предложенный учеными Института Вирусологии Аргентина. Ими был разработан способ иммуноферментного анализа позволяющий обнаруживать в сыворотке крови антитела специфичные полипептидному антигену р 24 вируса лейкоза КРС. В результате тестирования 67 проб сывороток крови крупного рогатого скота была зарегистрирована более высокая чувствительность в сравнении с РДП. (24- ..,137,34, 122009,224-234) смотря на положительные результаты, при разработке данных способов в качестве иммуносорбента использовался антиген непосредственно нанесенный на носитель, что предполагает возможность неспецифической сорбции и как следствие - возможность ложноположительных результатов. Технической задачей изобретения является устранение отмеченных недостатков, повышение точности и эффективности детекции специфических антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота антител, которая решается за счет того, что сенсибилизация носителя(полистиролового планшета) проводится моноклональными антителами (МКА), которые фиксируют на своей поверхности специфичный полипептидный антиген р 24. Тестируемые специфические антитела связываются с антигеном р 24, с последующим выявлением образовавшегося комплекса с помощью антивидового пероксидазного конъюгата,активность которого проявляется хромогеном и 25695 оценивается с помощью спектрофотометра. Положительными будут считаться пробы,показатели оптической плотности которых в 2 и более раза превосходят оптическую плотность отрицательного контроля. В результате были определены следующие оптимальные режимы постановки сэндвич варианта для обнаружения специфических антигену р 24 антител. Оптимальной концентрацией моноклональных антител, при которой происходит максимальная иммобилизация их на твердой фазе,является 7 мкг/мл по концентрации белка. Процесс адсорбции МКА на твердой фазе протекает активно при температуре 4 в течение 16-18 часов в буферной системе с рН 9,5. Связывание МКА с антигеном и соединение специфического комплекса антителоантиген с тестируемыми антителами наиболее эффективно протекают при температуре 37 в течение 1 часа. Для разведения конъюгата, а также отмывки лунок планшета при постановке ИФА лучше результаты были получены при использовании забуференного физиологического раствора (ЗФР) с 0,05 содержанием твина-20,который снижает неспецифическое связывание реагентов и,следовательно,обеспечивает наименьший фоновый сигнал реакции. Проявление ферментативной реакции следует проводить в темном месте в течение 20-25 мин. при комнатной температуре. Количественный учет результатов реакции необходимо проводить на спектрофотометре путем измерения оптической плотности реакционной жидкости в лунках, в которые вносились образцы исследуемых и контрольных проб при длине волны 450 нм против 620 нм. Получение моноклинальных антител осуществляли следующим образом Гибридизацию клеток миелом Х 63 8.653 и иммунных спленоцитов проводили по методу . ,.в стерильных условиях с использованием 50 раствора полиэтиленгликоля. Клонирование гибридом -продуцентов МКА проводили методом лимитирующих разведении (.. .). Для тестирования использовали непрямой вариант твердофазного иммуноферментного анализа на полистироловых планшетах (, Дания) иммобилизированные специфическим антигеном в концентрации 0,01 мг/мл в 0,05 М бикарбонатном буфере с рН 9,6 при 4 С в течение 18 часов. Константу связывания моноклональных антител определяли по методу .. Определение изотипов МКА проводили в реакции иммунодиффузии(РИД) со специфическими антисыворотоками к различным классам мышиных иммуноглобулинов (1,-2 ,-2 , -2 ,3,- ). Для подготовки иммуносорбента в лунки полистиролового планшета для иммунологических реакций вносят по 100 мкл раствора МКА в концентрации 7 мкг/мл на карбонат-бикарбонатном буферном растворе (КББ, рН 9,5). Для адсорбции антител планшет закрывают крышкой и инкубируют при 4 в течении 18 часов. После инкубации содержимое лунок планшета удаляют стряхиванием в сосуд с дезраствором и трехкратно отмывают,заполняя лунки до верхнего края забуференным физиологическим раствором с 0,05 твином 20(ЗФР-ТВ). Далее вносят по 100 мкл антигена в концентрации 10 мкг/мл в ЗФР. Планшет закрывают крышкой и инкубируют при 37 в течении 2 часов. Повторяют процедуру отмывки и высушивают иммуносорбент. В две лунки вертикального ряда сенсибилизированного планшета вносят по 0,1 см 3 исследуемой пробы, оставляя свободными первые 5 лунок первого ряда (лунки для контролей). В две лунки (А 1, В 1), вносят по 0,1 см 3 позитивного контроля (К), а в две (, 1) следующие по 0,1 см 3 негативного контроля (К-) соответственно. Закрывают планшет крышкой и инкубируют при температуре 37 в течение 1 часа. После окончания инкубации удаляют содержимое лунок с помощью автоматического промывателя или 8-канальной пипетки и промывают лунки четыре раза ЗФР-ТВ по 0,30 см 3, после чего избавляются от лишней влаги,постукивая планшетом по фильтровальной бумаге. Затем во все лунки планшета вносят по 0,1 см 3 раствора антивидового конъюгата и инкубируют при температуре 37 30 минут. По окончании инкубации удаляют раствор конъюгата из лунок с помощью автоматического промывателя или 8 канальной пипетки и промывают лунки шесть раз ЗФР-ТВ, после чего избавляются от лишней влаги,постукивая планшетом по фильтровальной бумаге. Вносят во все лунки планшета по 0,1 см 3 раствора хромогена (тиаминобензидин - ТМБ). Инкубируют планшет при комнатной температуре(18-22 С) в тмном месте 30 минут. Останавливают цветную реакцию внесением во все лунки по 0,05 см 3 стоп - реагента (0,5 М 24). Не более чем через 3 минуты после остановки цветной реакции, на спектрофотометре, определяют оптическую плотность (ОП) раствора в лунках при длине волны 450 нм против 620 нм. Учт результатов анализа Рассчитывают среднее значение оптической плотности (ОП) для лунок негативного контроля(ОП К-) и для позитивного контроля (ОП К). Проведение анализа считают корректным, если среднее значение ОП К не менее 0,5 ед.оптической плотности, а среднее значение ОП К- не более 0,2 ед. оптической плотности. Диагностическое значение оптической плотности (ОПд) определяют по формуле ОПдОП среднее К-0,14 Результаты анализа считают положительными,если значения ОП исследуемого образцаОПд. Результаты анализа считают отрицательным,если значения ОП исследуемого образца меньше 0,85 х ОПд. 25695 Результаты анализа считают сомнительным, если значения ОП исследуемого образца находится в диапазоне от 0,85 х ОПд до ОПд. Осуществление способа серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота приведен в следующем примере. Для обнаружения антител специфичных антигенам ВЛКРС предлагаемым способом исследовались 40 проб сывороток крови крупного рогатого скота в сравнении с реакцией иммунодиффузии в агаровом геле (РИД) и непрямым вариантом иммуноферментного анализа Таблица 1 - Сравнительные результаты тестирования проб сыворотки крови крупного рогатого скотапробы Результаты тестирования Непрямой ИФА Сэндвич ИФА на основе МКА 1 Примечание - - реакция отрицательная- реакция положительная В результате проведенных исследований определено, что предлагаемый сэндвич варианта ИФА позволяет избирательно выявлять в сыворотке крови животных антитела,специфичные 4 полипептидному антигену р 24. Установлено, что разработанная тест-система ИФА позволяет максимально снизить неспецифические реакции и выявлять специфические полипептидному антигену 25695 р 24 антитела с чувствительностью, не уступающей другим современным методам. Лабораторные способы ИФА имеют большое значение для проведения скриннинговых обследований в целях своевременной диагностики лейкоза КРС. Тест-система может найти применение в ветеринарии как официальный метод при исследованиях проб сывороток крови с целью экспресс-диагностики лейкоза КРС. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота, включающий детекцию специфических антител, отличающийся тем, что в качестве иммуносорбента используют полипептидный антиген р 24 сенсибилизированный на поверхности носителя посредством моноклональных антител.