Способ прогнозирования тяжести течения и смертности при системной красной волчанке у больных казахской национальности

(51) 01 33/48 (2011.01) 01 33/53 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к медицине, в частности к ревматологии и может быть использовано в клинической практике для прогнозирования тяжести течения и смертности при системной красной волчанке (СКВ). Техническим результатом изобретения является повышение надежности и точности прогнозирования. Это достигается тем, что в заявляемом способе прогнозирования тяжести течения и смертности при системной красной волчанке,включающем исследование крови,согласно изобретению,исследуют кровь у больных казахской национальности,проводят молекулярно генетический анализ, определяют генотип гена, и при носительствегенотипа прогнозируют тяжелую форму течения заболевания с возможным летальным исходом.(72) Омарбекова Жазира Есенгельдиевна Иванова Райфа Латыфовна Святова Гульнара Салаватовна Березина Галина Михайловна(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЯЖЕСТИ ТЕЧЕНИЯ И СМЕРТНОСТИ ПРИ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКЕ У БОЛЬНЫХ КАЗАХСКОЙ НАЦИОНАЛЬНОСТИ 25489 Изобретение относится к медицине, в частности к ревматологии и может быть использовано в клинической практике для прогнозирования тяжести течения и смертности при системной красной волчанке (СКВ). Известен способ прогнозирования тяжести течения СКВ, которую определяли с помощью индексовитакже рассчитывали индекс повреждения / (ИП). Для выявления прогностических факторов использовалась множественная линейная регрессия и бинарная логистическая регрессия. 5-летняя выживаемость больных СКВ составила 87,5. Отмечено нарастание повреждения с 1,241,29 до 2,581,89 балла через 5 лет (р 0,001). Наибольший вклад в нарастание ИП вносило поражение репродуктивной, нервной, сердечно-сосудистой и костно-мышечной систем. Основными факторами,определяющими неблагоприятный прогноз у больных СКВ, являются поздний дебют СКВ,высокое начальное повреждение и отсутствие быстрого ответа на терапию.(Зборовский А.Б., Сущук Е.А. Факторы,определяющие неблагоприятный прогноз при системной красной волчанке. Результаты 5-летнего наблюдения // Терапевт, арх.- 2009.- 81,6.- с. 1619). Недостатком данного способа является то, что анализ клинических синдромов может свидетельствовать лишь о факте наличия системных поражений, но не позволяет спрогнозировать эффективность терапии. Известен также способ прогнозирования тяжести течения системной красной волчанки путем определения процента 43 Т-клеток (Кл) и 425 Т-Кл у больных. По сравнению с контролем у больных СКВ доля 43 Т-Кл была значительно выше и коррелировала с клинической активностью заболевания.(Экспрессия 3 в 4 Т-клетках больных системной красной волчанкой. Сравнительный фенотипический анализ. 34 Т/.,., .,,.// ..- 2008 - 67,5.- с. 664-671.) Недостатком данного способа является то, что иммунологические показатели являются неспецифичными и косвенно судят о поражении иммунной системы при многих аутоиммунных заболеваниях и не могут быть использованы для персонификации прогноза лечения. Задачей изобретения является создание более точного способа прогнозирования тяжести течения и смертности при системной красной волчанке у больных казахской национальности, позволяющего повысить надежность и точность определения развития заболевания, обусловленного генетическими факторами, что в свою очередь даст возможность в выборе оптимальной стратегии и тактике лечения данной категории больных. Техническим результатом изобретения является повышение надежности и точности прогнозирования. Это достигается тем, что в заявляемом способе прогнозирования тяжести течения и смертности при системной красной волчанке,включающем исследование крови,согласно изобретению,исследуют кровь у больных казахской национальности,проводят молекулярно генетический анализ, определяют генотип гена, и при носительстве АА генотипа прогнозируют тяжелую форму течения заболевания с возможным летальным исходом. Способ осуществляется следующим образом. Молекулярно-генетическое исследование у больных казахской национальности проводят в несколько этапов. Выделение ДНК из периферической крови обследуемых проводят на станции выделения ДНК/РНК 6100 фирмысогласно протоколу, прилагаемому к данным реагентам. Для анализа полиморфизма 308 генаиспользуют диагностический набор праймеров и рестриктаз, рассчитанный на анализ 100 образцов ДНК производства ООО Центр молекулярной генетики (г. Москва, Россия) (код набора - ). Амплификацию ДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с применением специфичных олигонуклеотидных праймеров проводят на амплификаторе(США) в 23 мкл реакционной смеси. ПЦР проводят по схеме начальная денатурация (95, 5 мин.) 30 циклов амплификации со следующими параметрами 1) денатурация - 94, 1 сек 2) отжиг - 66 С, 1 сек 3) синтез - 72, 1 сек после чего проводят инкубацию при 72 С в течение 7 минут. Амплифицированные фрагменты подвергают ферментативному гидролизу с использованием фермента рестрикции, который способствует выпадению сайта рестрикции при наличии мутации. В 3 мкл рестрикционной смеси добавляют 12 мкл амплификата. Полученную смесь после центрифугирования подвергают термостатированию при 37 и в течение ночи. Полученные гидролизаты оценивают путем проведения вертикального электрофореза в 7-ном полиакриламидном геле(ПАА) при напряжении поля 160 В/см в течение 5060 мин. В качестве электрофорезного буфера используют однократный трис-боратный буфер. В качестве маркера используют образцы амплифицированной ДНК до рестрикции и маркер молекулярного веса 100 По окончании электрофореза гель окрашивают бромистым этидием (0,1 мкг/мл) в течение 10-15 минут и визуализируют в проходящем ультрафиолетовом свете. Детекцию результатов электрофореза проводят с использованием Системы документации гелей -(, США). Длины рестрицированных фрагментов регистрируют на геле в виде полос следующего размера в случае аллеля- 12820 п.н., в случае аллеля А -148 п.н. 25489 Длина амплифицированного фрагмента составляет 148 п.н. (пар нуклеотидов). После проведения рестрикционного анализа на геле регистрируют полосы- в случае аллеля А - 148 п.н. В случае наличия у обследуемого неизмененного нормального генотипана геле вместо исходного фрагмента в 148 п.н. регистрируют фрагмент в 128 п.н. При наличии гетерозиготной мутации / исходный фрагмент в 148 п.н. заменяют на полосы в 128 и 20 п.н., при наличии функционально ослабленного(мутантного) аллеля А в гомозиготном состоянии (генотип АА) на ПАА геле регистрируют фрагмент в 148 п.н. Таким образом, в результате проведения молекулярно-генетического анализа у обследуемого выявляют один из 3 генотипических вариантов генапо его полиморфизму 308. Частоты аллелей и их ошибки определяют с использованием пакета статистической программы-1 (, 1981). Силу ассоциаций выражают в значениях относительного риска(),рассчитанного как относительный шанс ( ) по формуле(а) / ( х с), где- число лиц с наличием и- с отсутствие генетического маркера среди больных,и- число лиц соответственно с наличием и отсутствием этого маркера среди здоровых в том случае, когда один из показателей равен 0, относительный риск вычисляют по модифицированной формуле(2 а 1)(2) / нет ассоциации,О 1 рассматривают как положительную ассоциацию заболевания с аллелем или генотипом (фактор риска) и О 1 - как отрицательную ассоциацию(фактор устойчивости), т.е. рассматривают значения О 1 как фактор риска развития данной патологии,как предохраняющий фактор. Течение заболевания у больных казахской национальности с генотипом АА имеет прогностически неблагоприятный характер с подострым течением, высокой степенью активности с тяжелым поражением почек и высокой смертностью. Пример 1. Больная Ж., 22 лет, инв.группы,госпитализирована в ревматологическое отделение с целью коррекции лечения 24.01.2007 г. Жалобы при поступлении слабость,сердцебиение, спонтанное образование синячков по телу, похолодание и онемение пальцев кистей,периодически головные боли, боли в мелких суставах кистей, пастозность лица, отеки нижних конечностей. Анамнез заболевания больна с июля 2005 г. Дебют заболевания с полиартрита мелких суставов кистей, яркого покраснения лица в виде бабочки,который был расценен больной аллергическим дерматитом на крем. Обратилась за медпомощью в сентябре 2005 г. когда присоединились признаки нефрита в виде пастозности лица, отечности нижних конечностей, при амбулаторном обследовании выявлены протеинурия, изменения в мочевом осадке. Госпитализирована в ревматологическое отделение в ноябре 2005 г., выставлен диагноз системная красная волчанка, острое течение, акт. . Проведена агрессивная иммуносупрессивная пульстерапия, с базовой пероральной дозой преднизолона 35-40 мг/сут, который в дальнейшем снизила до поддерживающей 15 мг/сут. За время болезни получала неоднократное стационарное лечение в ревматологическом отделении с клиникой рецидивирующего нефротического синдрома для купирования которого назначен препарат мофетила микофеналат(селлсепт). Последняя госпитализация в связи с резким ухудшением состояния, во время пребывания заграницей, от лечения в НИИ ревматологии г.Москва отказалась,была доставлена в Казахстан, госпитализирована в МЦ ГМУ г.Семей с клиникой нарастающей хронической почечной недостаточности. Объективные данные состояние больной тяжелое,заторможена. Кожа бледная, сухая. Одутловатое бледное лицо, умеренный кушингоид. Стрии на спине и бедрах. Синячки на плечах и бедрах,капилляриты, сетчатое ливедо. Хорошо развита подкожно-жировая клетчатка. Пальпируются подчелюстные, шейные лимфоузлы размером с фасоль, подвижные, безболезненные. Пальцы рук и ног холодные на ощупь, синюшные. Костносуставная система артралгии мелких суставов кистей. В легких везикулярное дыхание,ослабленное в нижних отделах с единичными влажными хрипами. Сердечные тоны приглушены,ритмичны, пульс 102 ударов в мин., АД 180/140. Живот при пальпации мягкий, безболезненный. Печень и селезенка не увеличены. Отеки нижних конечностей. В общеклиническом анализе крови гемоглобин 65 г/л, эритроциты -2,21012/л, лейкоциты - 8,9109/л, СОЭ - 38 мм/ч В общеклиническом анализе мочи белок - 4,95 г/л, уд.вес 1015, лейкоциты 2-3-3, эритроциты 5-6-7,цилиндры 2-3-2. Биохимический анализ фибриноген 446 ммоль/л, общий белок 48, мочевина 16,6, креатинин 5,8,клетки , люпус-тест 1,34. Коагулограмма 0,76 протромбиновое время 13,5 сек., ПТИ 111,1 АПТВ 26,4 РФМК 6,5. Флюорография гипертрофия левого желудочка,перикардит. Эхокардиография увеличение полостей левых отделов сердца, гипертрофия межжелудочковой перегородки, диастолическая дисфункция левого желудочка,уплотнение стенок аорты,недостаточность митрального клапанастепени. УЗИ почек признаки гломерулонефрита,незначительное количество жидкости в брюшной полости. Клинический диагноз СКВ, подострое течение,активность , нефрит с нефротическим синдромом ХПН Б-, капиллярит, сетчатое ливедо, с.Рейно,с.Верльгофа,лимфоаденопатия,анемия. 25489 Гормонозависимость, с.Иценко-Кушинга, Симптоматическая артериальная гипертензия. При проведении молекулярно генетического исследования выявлен генотип АА, при котором развитие системной красной волчанки имеет прогностически неблагоприятный характер,особенно в прогнозе тяжелого поражения почек в дебюте заболевания. Несмотря на проводимую адекватную терапию, больная погибает от тяжелого волчаночного гломерулонефрита, рефрактерного к терапии, через 2 года с момента начала болезни. Пример 2. Больная И., 34 лет, инв.группы,госпитализирована в ревматологическое отделение в декабре 2006 г. Жалобы при поступлении пигментация на лице,боли в мелких суставах кистей и локтевых суставах,кратковременная утренняя скованность, головные боли с повышением артериального давления,похолодание и зябкость пальцев кистей, слабость. Анамнез заболевания страдает системной красной волчанкой с 1992 г. (стаж болезни 14 лет). Дебют заболевания с яркого дерматита на лице,лихорадки, полиартралгий мелких и крупных суставов, хейлита и стоматита. На 4-й год от начала заболевания наблюдался волчаночный криз с высокой степенью активности с признаками нефрита с нефротическим синдромом, который был купирован проведенной пульс - терапией, в дальнейшем получила курсовое лечение циклофосфаном в течение 1,5 лет, поддерживающая доза преднизолона 5-10 мг/сут. В 2005 г. наступает беременность, которая была пролонгирована под контролем ревматолога и гинеколога, волчаночный процесс минимальной степени активности, роды благополучные, но ребенок умирает на 2-й день от внутриутробной пневмонии. Настоящая госпитализация спустя 8 месяцев после родов. Госпитализирована в плановом порядке в с умеренной активностью заболевания с целью коррекции лечения. Объективные данные состояние средней степени тяжести. Кожа обычной окраски, на лице элементы гиперпигментации с очагами атрофии после дерматита. Хейлита, стоматита, капиллярита не наблюдается. Пальпируются подчелюстные лимфатические узлы с фасоль, подвижные,безболезненные. Подкожно-жировая клетчатка умеренно развита. Костно-суставная система полиартралгия мелких суставов кистей и локтевых суставов, движения в суставах в полном объеме. В легких везикулярное дыхание, хрипов нет. Сердечные тоны приглушены, ритмичны, пульс 76 ударов в мин., АД 100/60. Живот при пальпации мягкий, безболезненный. Печень и селезенка не увеличены. Отеков нет. В общеклиническом анализе крови гемоглобин 134 г/л, эритроциты -4,4 1012/л, лейкоциты - 3,0109/л, СОЭ -23 мм/ч. В общеклиническом анализе мочи белок - нет,уд.вес 1021, лейкоциты 2-3-3, эритроциты 0-1-2,эпителий 3-5-2. Биохимический анализ фибриноген 355 ммоль/л, диспротеинемии нет, СРБ , общий белок 65, мочевина 7,3, креатинин 0,018,клетки не найдены, люпус-тест 1,03. Коагулограмма 0,98 протромбиновое время 14 сек., ПТИ 111,1 АПТВ 27,3 РФМК 4,5. Флюорография без патологии. Эхокардиография полостные размеры сердца не расширены, диастолическая дисфункция левого желудочка,уплотнение стенок аорты,сократительная способность миокарда левого желудочка удовлетворительная, фракция выброса 65. УЗИ почек признаки холецисто-панкреатита,мочекислого диатеза. УЗИ щитовидной железы контуры долей и перешейка ровные,структура диффузно неоднородная, единичные узловые образования в обеих долях, признаки аутоиммунного тиреоидита. Клинический диагноз Системная красная волчанка, хроническое течение, акт., дерматит,полиартралгия,лимфоаденопатия,лейкопения аутоиммунный тиреоидит. При молекулярно - генетическом исследовании выявлен протективный генотип , что позволяет прогнозировать течение волчаночного процесса в более доброкачественной форме с хорошим ответом на терапию, даже при наличии в дебюте тяжелых висцеральных синдромов как нефрит, а также спрогнозировать вынашивание возможной беременности. Для оценки значимости генав формировании подверженности развития СКВ в казахской этнической группе изучено распределение частот аллелей и генотипов данного гена между здоровыми лицами и больными СКВ. Частоты генотипов и аллелей генапо его полиморфизму 308 в основной и контрольной группах исследования представлены в таблице(в ). Таблица Генотипы, аллели Больные СКВ 34 Контроль 100 2 16 23,55,1 133 66,53,3 36,2 0,00001 Всего 68 100,0 200 100,0 Примечание- имеются достоверные отличия от показателей контрольной группы,0,05 25489 Как видно из таблицы, частота нормального генотипав основной группе составила 5,94,0 и является более низкой в сравнении с показателем контрольной группы(37,04,8),различия статистически достоверны (210,45 р 0,0012). Частота гетерозиготного генотипав основной группе составила 35,38,2 и имеет достоверное отличие от данных контрольной группы (59,04,9) (24,8 р 0,028). Получены достоверно высокие частоты гомозиготного по мутантному аллелю генотипа АА- 58,88,4 и мутантного аллеля А - 76,55,1 в основной группе в отличие от данных группы контроля (4,02,0, 33,53,3, 248,2 и 236,2 соответственно р 0,00001). Частота нормального аллелясоставляет 23,55,1 в основной группе и является достоверно более низкой, чем в контрольной группе (66,53,3)(236,2 р 0,00001). Таким образом, частоты нормального генотипаив основной группе достоверно более низкие,а частоты мутантного (патологического) генотипа АА и аллеля А достоверно более высокие в группе больных в отличие от группы здорового контроля(р 0,05). Данные по распределению генотипов полиморфизма 308 генав основной и контрольной группах подтверждаются значениями коэффициента относительного риска,позволяющего определить степень риска развития патологии с учетом носительства различных генотипов и гаплотипов. Выявлено, что при наличии у пациента гомозиготного мутантного генотипа АА риск развития провоспалительных процессов в организме увеличен в 34,3 раза, носительство аллеля А увеличивает риск их возникновения в 6,5 раза. Полученные результаты свидетельствуют о наличии взаимосвязи носительства патологического мутантного аллеля А генас развитием изучаемой патологии. Носительство неблаго приятного генотипа АА и аллеля А в гетерозиготном состоянии гена, является статистически достоверным генетическим фактором риска развития провоспалительных процессов в организме пациентов с СКВ в казахской популяции,что подтверждается значениями коэффициента относительного риска . Сопоставляя полученные генетические результаты с клиническим течением заболевания обследованных больных, выявлено, что у лиц,имеющих генотип АА, заболевание носит преимущественно подострое течение с тяжелой степенью активности, с поражением почек с нефротическим синдромом и осложненным почечной недостаточностью и имеют прогностический неблагоприятный характер с высокой смертностью. Из числа 34 протестированных нами больных за прошедшие 3 года умерло 9 больных, что составило 26, их них в 67 случаев пациенты имели генотип риска АА. Таким образом, заявляемый способ повышает точность прогноза течения системной красной волчанки, особенно е тяжелой клинической формы люпус-нефрита, позволяет определить активность течения процесса и с учетом подбора адекватной фармакотерапии повысить эффективность лечения и выживаемость больных. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ прогнозирования тяжести течения и смертности при системной красной волчанке,включающий исследование крови, отличающийся тем, что исследуют кровь у больных казахской национальности,проводят молекулярно генетический анализ, определяют генотип гена, и при носительстве АА генотипа прогнозируют тяжелую форму течения заболевания с возможным летальным исходом.