Способ получения аллергена для диагностики чумы верблюдов

(51) 61 39/02 (2006.01) 61 10/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(72) Сембина Фатима Егимбаевна Намет Айдар Мырзахметлы Каратаев Болат Шайзадаевич(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЛЕРГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЧУМЫ ВЕРБЛЮДОВ(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности к способам получения диагностических препаратов и может быть использовано при изготовлении аллергена для диагностики чумы верблюдов. Технический результат,обеспечиваемый изобретением выражается в изыскании оптимального способа экстракции основного соматического антигена чумного микроба с помощью 0,2 тритона Х-100, который вызывает формирование видимой зоны преципитата в РДДП в титре 112800, ЛПС- 180, 1 - 140. Способ получения основного соматического антигена чумного микроба для изготовления аллергена, включающий 20 ч культивирование,смыв физиологическим раствором,центрифугирование,экстракцию основного соматического антигена трихлоруксусной кислотой в 10 кратном количестве,последующее центрифугирование, нейтрализацию надосадочной жидкости, диализ, осаждение и лиофилизацию конечного продукта, достигается тем, что в качестве исходного материала используют вакцину чумную сухую живую из штамма, которую регидратируют физиологическим раствором, затем экстрагируют 0,2 раствором тритона -100 в соотношении 15, полученную смесь подвергают 9 ч непрерывному перемешиванию в шуттель-аппарате при 37 С, после чего центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин, осадок отбрасывают,а полученную надосадочную жидкость диализуют против дистиллированной воды в течение 36 ч,затем к диализованному раствору добавляют 5 объемов этилового спирта 96,смесь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин,полученный осадок разводят стерильным физиологическим раствором и получают целевой продукт. 21433 Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности к способам получения диагностических препаратов и может быть использовано при изготовлении аллергена для диагностики чумы верблюдов. Известен способ получения аллергена для диагностики чумы верблюдов, включающий 20 ч культивирование чумного микроба,смыв физиологическим раствором, центрифугирование,экстракцию основного соматического антигена трихлоруксусной кислотой в 10 - кратном количестве,последующее центрифугирование,нейтрализацию надосадочной жидкости, диализ,осаждение и лиофилизацию конечного продукта Шамардин В.А., Тугамбаев Т.И В кн. Диагностические сорбированные иммунореагенты,Алматы, 1989, с. 30-31 Недостатком этого способа является то, что при воздействии на клетки возбудителя чумы трихлоруксусной кислотой в реакции двойной диффузной преципитации выявляются зоны преципитата не только к соматическому антигену,но и к капсульному и к липополисахаридному антигенам. Задачей изобретения является получение аллергена из основного соматического антигена чумного микроба с низким содержанием сопутствующих антигенов. Технический результат,обеспечиваемый изобретением выражается в изыскании оптимального способа получения аллергена путем экстракции основного соматического антигена чумного микроба. Способ получения аллергена для диагностики чумы верблюдов из основного соматического антигена чумного микроба включает в себя регидратацию физиологическим раствором вакцины чумной сухой живой из штамма,затем экстракцию 0,2 раствором тритона Х-100 в соотношении 15, полученную смесь подвергают 9 ч непрерывному перемешиванию в шуттель-аппарате при 37 С, после чего центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин, осадок отбрасывают,а полученную надосадочную жидкость диализуют против дистиллированной воды в течение 36 ч,затем к диализованному раствору добавляют 5 объемов этилового спирта 96,смесь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин,полученный осадок разводят физиологическим раствором и определяют концентрацию белка и аллергическую активность препарата, исследуют на стерильность,токсичность,пирогенность,отсутствие сенсибилизирующих свойств и специфичность. В качестве исходного материала используют вакцину чумную сухую живую из штамма. Указанный штамм бактерий депонирован в музее живых культур микроорганизмов РГКП Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций им. М. Айкимбаева. Идентификацию штамма бактерийпроводят по морфологическим, культуральным,физиолого-биохимическим свойствам. 2 Морфологические признаки. Бактерии штамма грамотрицательные округлые палочки от 1-2 х 0,30,7 мкм, неподвижные, имеют капсулу, спор не образуют. Культуральные свойства. На агаре Хоттингера вырастают шероховатые, в центре бугристые желтовато-белые, на периферии с кружевной каймой колонии в -форме. Накопление бакмассы наблюдают через 24-48 ч выращивания. В питательном бульоне образуют хлопьевидный,легко распадающийся при встряхивании осадок. Аэробы. Оптимальная температура выращивания 28-30 С, рН 7,0-7,2. Биохимические свойства. Не продуцируют уреазу и ацетилметилкарбинол, не разжижают желатин, не расщепляют маланат, не образуют 2,индол, ацетоин. Проба на диссоциацию. По Грамму колонии окрашиваются как -форма. Патогенные свойства. Авирулентен для белых мышей и морских свинок. Серологические свойства. Синтез капсульного антигена - фракция 1, титр в РНГА с чумной агглютинирующей диагностической сывороткой не ниже 1200000. Физиолого-биохимические свойства. Хемогетеротроф. Тип катаболизма - аэроб. Оптимальный рН - 7,0-7,2. Источники углерода манит, манноза, глюкоза,мальтоза, маннитол, сорбитол, амигдалин. Источники азота аминокислоты в составе питательных сред. Источники серы аминокислоты в составе питательных сред. Биохимические маркерные признаки не ферментирует лактозу, сахарозу, рамнозу, глицерин,дает положительный результат в реакции денитрификации. Физиологические маркерные признаки природный ауксотроф, нуждается в метионине,цистеине, фенилаланине и треонине. Хранение на питательной среде. Предварительно культивируют на агаре Хоттингера с добавлением 0,1 гемолизированной крови при температуре 28 С в аэробных условиях, хранят в лиофильно высушенном состоянии при температуре 4-6 С в течение 36 мес. Способ получения аллергена для диагностики чумы верблюдов заключается в следующем. Пример 1. Вакцину чумную сухую живую из штаммарегидратируют физиологическим раствором, затем экстрагируют 0,2 раствором тритона Х-100 в соотношении 15,полученную смесь подвергают 9 ч непрерывному перемешиванию в шуттель-аппарате при 37 С,после чего центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин, осадок отбрасывают, а полученную надосадочную жидкость диализуют против дистиллированной воды в течение 36 ч, затем к диализованному раствору добавляют 5 объемов этилового спирта 96, смесь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин, полученный осадок 21433 разводят физиологическим раствором. При постановке РДДП с кроличьими иммунными сыворотками,полученными иммунизацией животных изолированными антигенами - ОСА,ЛПС, 1, формирование видимой зоны преципитата у ОСА, полученного экстракцией 0,2 раствором тритона Х-100, возникает в титре 112800, ЛПС 180,1 140. Полученные результаты исследований дают основание считать, что применение способа экстракции с помощью 0,2 раствора тритона Х 100 повышают антигенную активность и количественное содержание основного соматического антигена чумного микроба. Пример 2. После экстракции основного соматического антигена определяют в полученном препарате концентрацию белка и аллергическую активность препарата. Определение количества белка по Лоури проводят путем наложения полученных результатов на спектрофотометре цифровых значений оптической плотности испытуемого препарата на калибровочную линию. На оси абсцисс отображается концентрация белка. Содержание белка в пробе при рН 7,0-7,2 составила 2,7-3,0 мг в 1 мл. Для определения аллергенной активности основного соматического антигена была выявлена его гиперергическая реактивность в опытах. опыт были взяты морские свинки, предварительно иммунизированные живой чумной вакциной ЕВ. Вакцинацию проводили подкожно дозой в 1 млн. микробных клеток. Через месяц после иммунизации ставили внутрикожную пробу на боковой поверхности туловища морской свинки с препаратом соматического антигена чумного микроба при содержании в 0,1 мл физиологического раствора различных доз препарата - 30, 50, 70 мкг. Для этой цели использовали безыгольный инъектор,настроенный согласно требованиям инструкции по применению прибора на внутрикожный режим введения препаратов в объеме 0,1 см 3. О глубине проникновения препарата судили по предварительным опытам с введением морским свинкам внутрикожно физиологического раствора с 1 туши. После рассечения тканей на месте инъекции, при правильной настройке аппарата было видно, что тушь инфильтрировала только кожу. Аллергическую реакцию учитывали через 24 часа после постановки пробы. Положительная реакция характеризовалась наличием гиперемии и уплотнения кожи. Только гиперемию без других сопутствующих явлений не принимали во внимание при оценке реакции. Реакцию считали положительной при наличии уплотнения не менее 10 мм в диаметре. При отрицательных реакциях краснота и незначительное уплотнение исчезали через 24 часа, у положительно реагирующих уплотнение и краснота сохранялись 3-4 суток. Результаты интенсивности кожной реакции у морских свинок на введение аллергена приведены в таблице 1. Из данных табл. 1 следует, что при введении препарата в 50 и 70 мкг интенсивность кожной реакции одинакова, в среднем по 5,8 мм, а при введении дозы в 30 мкг, размеры папул в два раза меньше. Результаты активности препаратов соматического антигена при регистрации аллергического состояния у иммунных к чуме морских свинок приведены в таблице 2. Из табл. 2 следует, что из привитых чумной вакциной морских свинок положительно реагировали на аллерген, введенный в дозе 30 мкг 4, в дозе 50 мкг - 5, в дозе 70 мкг - 5 морских свинок, при 100 отрицательной реакции у контрольных неиммунизированных свинок. Если оценивать аллергенную активность различных доз исследуемого препарата, при которых взятые животные отвечают гиперергической реакцией, то становится очевидным, что доза в 50 мкг наиболее оптимальная для внутрикожного введения. Пример 3. Аллерген, полученный предлагаемым способом, был проверен на стерильность,токсичность,пирогенность,отсутствие сенсибилизирующих свойств и специфичность. Стерильность аллергена изучали путем посева его на мясо-пептонный агар и мясо-пептоный бульон. На каждую среду (по пять пробирок) высевали по 0,25 см препарата, растворенного в физиологическом растворе до концентрации 1 мг/см 3. Посевы выдерживали в термостате при 37 С и 28 С. Через 10 дней в пробирках роста обнаружено не было, что свидетельствовало о стерильности препарата. Токсичность препарата изучали на здоровых белых мышах (10 особей), весом 20-25 г и морских свинках (6 особей), весом 300 г. Внутривенное введение 0,02 мг аллергена белым мышам и внутрисердечное введение 0,3 мг морским свинкам не вызывало гибели животных в течение 48 часов. На вскрытии у большинства забитых через 48 часов животных была обнаружена лишь инъекция сосудов подкожной клетчатки. При испытании препарата на пирогенность аллерген вводили кроликам внутримышечно. В течение суток температура тела оставалась в пределах нормы (38,8 С). У контрольных животных,которым вводили дистиллированную воду, подъема температуры тела также обнаружено не было. Отсутствие сенсибилизирующих свойств или иммунологическую безвредность аллергена проверяли на здоровых морских свинках (6 голов). Трем морским свинкам вводили трехкратно по 50 мкг препарата в объеме 0,1 см 3 стерильного физиологического раствора с интервалом 5 суток. Три свинки были контрольными. Через 15 суток всем животным вводили внутрикожно по 50 мкг аллергена в 0,1 см 3 стерильного физиологического раствора. Через 24 часа проводили читку реакции. У всех животных на месте введения наблюдалось покраснение не более 5 мм, что указывало на отсутствие сенсибилизирующих свойств у предлагаемого препарата. Степень специфичности внутрикожной пробы с предлагаемым аллергеном изучали на морских свинках, иммунизированных живыми вакцинами против чумы и туляремии в дозе 1 млн микробных 3 21433 клеток. Каждой морской свинке, взятой в опыт,ставили одновременно на обоих боках внутрикожные пробы со специфическим и неспецифическим аллергенами в количестве 0,01 мг в 0,1 см 3. На внутрикожное введение аллергена положительно реагировали только свинки,иммунизированные против чумы. Животные,иммунизированные против туляремии положительно реагировали только на специфические аллергены. Эти данные свидетельствовали о специфичности полученного нами препарата. В целом, результаты изучения биологических свойств чумного аллергена отражены в табл. 3. Из данных табл. 3 следует, что полученный препарат стерилен, безвреден, апирогенен, не обладает сенсибилизирующими свойствами и специфичен. Таблица 1 Интенсивность кожной реакции у морских свинок на введение аллергена Размеры папул через 24 часа, в мм 3 3 3 2 2,2 5 6 5 7 6 5,8 5 6 7 6 5 5,8 Таблица 2 Активность препаратов соматического антигена при регистрации аллергического состояния у иммунных к чуме морских свинок Животные Эффект внутрикожной пробы с аллергеном 45 55 55 05 05 05 Числитель - число положительно реагировавших Знаменатель - количество животных в опыте Таблица 3 Результаты изучения биологических свойств чумного аллергена Наименование показателей Внешний вид, цвет, растворимость Показатель рН (водородные ионы) Стерильность Токсичность Пирогенность Сенсибилизирующие свойства Специфичность 4 Характеристика Аморфный порошок, светлокремового цвета, растворим в дистиллированной воде и физиологическом растворе 7,0-7,2 Стерилен Безвреден Апирогенен Отсутствуют Специфичен 21433 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения аллергена для диагностики чумы верблюдов,включающий 20 ч культивирование чумного микроба,смыв физиологическим раствором, центрифугирование,экстракцию основного соматического антигена трихлоруксусной кислотой в 10 - кратном количестве,последующее центрифугирование,нейтрализацию надосадочной жидкости, диализ,осаждение и лиофилизацию конечного продукта,отличающийся тем, что в качестве исходного материала используют вакцину чумную сухую живую из штамма, которую регидратируют физиологическим раствором, а в качестве вещества для экстракции используют 0,2 раствор тритона Х-100 в соотношении 15,полученную смесь подвергают 9 ч непрерывному перемешиванию в шуттель-аппарате при 37 С,после чего центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин, осадок отбрасывают, а полученную надосадочную жидкость диализуют против дистиллированной воды в течение 36 ч. затем к диализоваиному раствору добавляют 5 объемов этилового спирта 96, смесь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин, полученный осадок разводят стерильным физиологическим раствором и получают целевой продукт.