Способ получения инактивированной вакцины против туберкулеза животных

(12 1/20, 12 132) ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(72) Кадыров Серик Оразбаевич Клышев Тельман Лукбанович Тургенбаев Кайрат Алтынбекович Сактаганов Кудайберген Дуйсбаевич(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ТУБЕРКУЛЕЗА ЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности, к способам изготовления противотуберкулезной вакцины, и может быть использовано в профилактике туберкулеза животных. Способ получения инактивированной вакцины против туберкулеза животных включает выращивание микобактерий туберкулеза бычьего вида штамма 8 на жидкой синтетической питательной среде в течение 45-60 суток, инактивирование при 120 С в течение 1 часа, отделение фильтрованием бактериальной массы от культу ральной жидкости, суспендирование бактериальной массы в 0,2-0,4 растворе тритона Х-100 в гомогенизаторе при 3000-5000 об/мин в течение 10-15 минут, выдерживание в течение 12-24 часов в термостате при температуре 40-50 С для лизирования,контроль лизиса микобактерий микроскопированием, разведение физиологическим раствором до концентрации белка в целевом продукте 1-5 мг в 1 мл,внесение в культуральную жидкость 50 раствора трихлорукусусной кислоты из расчета 3-5 к объему жидкости и выдерживание при 4-6 С в течение 12-24 часов, центрифугирование при 1800 об/мин,отделение и добавление к нему физиологического раствора до концентрации белка 1-5 мг в 1 мл в целевом продукте, смешивание полученных целевых продуктов в равных объемах, адсорбирование полученной смеси гидроксалом в соотношении 11,добавление в равном объеме смеси экстракта и дрожжевого РНК, адсорбированных гидроксалом в соотношении 11. Технический результат, обеспечиваемый изобретением, выражается в повышении иммуногенности и создании достаточно напряженного иммунитета при введении препарата в организм животного. 9075 Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности, к способам изготовления противотуберкулезной вакцины, и может быть использовано в профилактике туберкулеза животных. Известен способ получения инактивированной вакцины против туберкулеза животных, включающий выращивание микобактерий на жидкой питательной среде, инактивацию, лизирование и осаждение целевого продукта с последующим адсорбированием гидроксалом (а. с. СССР 1338859, кл. А 61 К 39/04, 1987). Недостатком данного способа является низкая активность полученной при этом иммуногенной фракции микобактерий туберкулеза при формировании в организме животного противотуберкулезного иммунитета. Задачей изобретения является разработка способа получения инактивированной вакцины против туберкулеза животных, которая создает достаточно напряженный иммунитет при введении в организм животного и обладает слабыми реактогенными свойствами. Способ получения инактивированной вакцины против туберкулеза животных включает выращивание микобактерий туберкулеза бычьего вида штамма 8 на жидкой синтетической питательной среде в течение 45-60 суток, инактивирование при 120 С в течение 1 часа, отделение фильтрованием бактериальной массы от культуральной жидкости, суспендирование бактериальной массы в 0,2-0,4 растворе тритона Х-100 в гомогенизаторе при 3000-5000 об/мин в течение 10-15 минут, выдерживание в течение 12-24 часов в термостате при температуре 40-50 С для лизирования,контроль лизиса микобактерий микроскопированием, разведение физиологическим раствором до концентрации белка в целевом продукте 1-5 мг в 1 мл,внесение в культуральную жидкость 50 раствора трихлорукусусной кислоты из расчета 3-5 к объему жидкости и выдерживание при 4-6 С в течение 12-24 часов, центрифугирование при 1800 об/мин,отделение и добавление к нему физиологического раствора до концентрации белка 1-5 мг в 1 мл в целевом продукте, смешивание полученных целевых продуктов в равных объемах, адсорбирование полученной смеси гидроксалом в соотношении 11,добавление в равном объеме смеси экстракта и дрожжевого РНК, адсорбированных гидроксалом в соотношении 11. Изобретение осуществляется следующим образом. Штамм 8 выращивают на жидкой питательной среде Сотона в течение 4560 сут, инактивируют в автоклаве нагреванием при 120 С в течение 1 ч, отделяют бактериальную массу от культуральной жидкости путем фильтрования,затем бактериальную массу суспендируют в 0,20,4 -ном растворе тритона Х-100 в гомогенизаторе при 3000-5000 об/мин в течение 10-15 мин, после 2 чего выдерживают 12-24 ч в термостате при температуре 40-56 С путем контроля лизиса микобактерий микроскопированием, полученный при этом лизат разводят стерильным физиологическим раствором до концентрации белка 1-5 мг в 1 мл целевого продукта. В культуральную жидкость вносят 50 -ный раствор трихлоруксусной кислоты из расчета 3-5 -тов к объему жидкости и выдерживают при температуре 4-6 С в течение 12-24 ч, полученный при этом осадок отделяют центрифугированием при 18000 об/ мин, затем его суспендируют физиологическим раствором до концентрации белка 1-5 мг в мл целевого продукта. Затем полученные растворы целевых продуктов смешивают в равных объемах и адсорбируют гидроксалом в соотношении 11, затем берут в равных объемах иммуностимуляторы в виде экстракта тимуса и дрожжевого РНК, адсорбируют также в гидроксале в соотношении 11 и добавляют в равных объемах к адсорбированной смеси растворов целевых продуктов. Иммуногенность вакцины против туберкулеза и определение ее оптимальной дозы в эксперименте проводили на 24 кроликах в лабораторных условиях. Животных разбили на 6 групп и иммунизировали препаратами в различных сочетаниях. Первую группу прививали вакцинным комплексом 1, состоящим из центрифугата бактериальной массы, обработанным 0,2 -ным раствором тритона Х-100 50 -тов белка, осажденного из фильтрата культуры с содержанием белка 2,5 мг в 1 мл, вводили в дозе 1 мл подкожно в области бедра. Вторую группу прививали вакцинным комплексом 2 из лизата бактериальной массы, обработанным 0,4 -ным раствором тритона Х-100 с содержанием белка 1 мг в 1 мл 50 -тов белка, осажденного из фильтрата культуры, в дозе 1 мл подкожно. Третью группу - вакцинным комплексом 3 лизата из бактериальной массы с содержанием белка 2,5 мг в 1 мл в дозе 1 мл подкожно. Четвертая группа - вакцинный комплекс 4 из равной смеси ППД и СКЖ с содержанием белка 1 мг в 1 мл. Пятая группа - контроль с БЦЖ 0, 2 мг на 1 голову подкожно. Шестая группа - чистый контроль. Через три месяца после вакцинации всех кроликов заразили вирулентной культурой микобактерий бычьего вида в дозе 0,001 мг на голову и через 60 сут провели убой всех кроликов с последующим проведением паталогоанатомических и бактериологических исследований. При этом определяли индекс эффективности, индекс пораженности и процент эффективности вакцинных препаратов по методу Тогуновой А.И. с соавтор. (1951), ВейсФеллер Ю.К.(1975). Результаты экспериментальных исследований по отбору оптимального варианта вакцины представле 9075 ны в таблице. Таблица Результаты послеубойных исследований подопытных кроликов Индекс пораженности органов легких 1 2 1 1 3 1 4 Средний индекс по 1 группе 10 1 11 12 2 2 13 1 1 Средний индекс по 2 группе 17 1 18 3 2 1 19 20 2 2 1 Средний индекс по 3 группе 26 1 1 27 2 1 29 3 3 1 Средний индекс по 4 группе 30 1 1 31 2 2 32 3 2 2 33 3 2 Средний индекс по 5 группе (контроль с БЦЖ) 35 4 4 3 2 36 4 4 2 1 38 4 3 2 1 Средний индекс по 6 группе (контроль) Из таблицы видно, что отбор оптимального варианта вакцинного комплекса наиболее эффективен при сочетании лизата белка из бактериальной массы в смеси с белком из фильтрата культуры с содержанием белка 2,5 мг в 1 мл (группа 1). При этом индекс пораженности составляет по группе 1,75,индекс эффективности - 9,5, процент эффективности - 90,5 , а в группе кроликов, вакцинированных БЦЖ ( 5), соответственно 8,25 45 и 55 . В контрольной группе ( 6), где кролики не вакцинировались, индекс пораженности составляет 18,3. По результатам проведенных исследований предлагаемый препарат оказался более иммуногенным в сравнении с вакциной БЦЖ. В данной группе 90,5 животных противостояли заражению вирулентной культурой микобактерий бычьего вида в дозе 0,001 мг на голову в течение всего срока наблюдения, в то же время в группе кроликов, иммунизированных вакциной БЦЖ, только 55 противостояло заражению туберкулезом. Преимуществом применения инактивированной вакцины против туберкулеза является совмести мость вакцино- и химиопрофилактики. При одновременном же применении живых вакцин с химиопрепаратами защитный эффект вакцины сводится на нет. Предлагаемая вакцина позволяет обеспечить высокий поствакцинальный иммунитет против туберкулеза и предохранить животных от их заражения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения инактивированной вакцины против туберкулеза животных, включающий выращивание микобактерий на питательной среде, инактивацию, лизирование и центрифугирование, отличающийся тем, что в качестве микобактерий используют микобактерии туберкулеза бычьего вида штамма 8, которые выращивают на жидкой синтетической питательной среде в течение 45-60 суток, инактивируют при 120 С в течение одного часа, отделяют фильтрованием бактериальную массу от культуральной жидкости, бак 3 9075 териальную массу суспендируют в 0,2-0,4 растворе тритона Х-100 в гомогенизаторе при 30005000 об/мин в течение 10-15 минут, после чего выдерживают в течение 12-24 часов в термостате при температуре 40-50 С для лизирования, проводят контроль лизиса микобактерий микроскопированием, затем разводят физиологическим раствором до концентрации белка в целевом продукте 1-5 мг в 1 мл, а в культуральную жидкость вносят 50 раствор трихлоруксусной кислоты из расчета 3-5 к объему жидкости и выдерживают при 4-6 С в течение 12-24 часов, центрифугируют при 1800 об/мин,осадок отделяют и добавляют к нему физиологический раствор до концентрации белка 1-5 мг в 1 мл целевого продукта, после чего оба целевых продукта смешивают в равных объемах, полученную смесь адсорбируют гидроксалом в соотношении 11, добавляют в равном объеме смесь экстракта тимуса и дрожжевого РНК, адсорбированных гидроксалом в соотношении 11.