Штамм микроорганизма Escherichia coli BL21/E3.pET22/gp51 – продуцент рекомбинантного gp51 антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота

(51) 12 15/00 (2006.01) 12 1/21 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ методов диагностики ящура, а также в вирусологии для изучения биологических свойств вирусов. Штамм 21/3.32/51 продуцент рекомбинантного 51 антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота получали путем трансформации экспрессионной плазмиды Е 3.рЕТ 22 несущий ген 51 антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота. Изучение антигенных и биохимических свойств рекомбинантного 51 антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота проводили с использованием непрямого варианта иммуноферментного анализа, денатурирующего электрофореза в 15 полиакриламидном геле и иммуноблота. Для получения максимального количества полезного продукта применяется жидкая среда(триптона - 10 г, дрожжевого экстракта - 5 г,5 г, дистиллированная вода до 1000 мл, 50 мкг/мл канамицина, рН 7,5), инкубирование при 37 С, в течение 18-24 часов до 6000,8. После добавляют 0,2 мМ изопропил-,-тиогалактопиранозид) и инкубируют при 30 С в течение 6 часов. Максимальный концентрация рекомбинантного 51 антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота составляет 500 мкг/мл. Молекулярная масса рекомбинантного 51 антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота синтезируемый штамм продуцентом составляет 45 кДа.(72) Мукантаев Канатбек Найзабекович Муканов Касым Касенович Шустов Александр Вячеславович Райымбек Гульжан Турсунов Канат Ахметович Бегалиева Асем Амангельдаевна Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ШТАММ МИКРООРГАНИЗМА 21/3.22/51 ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО 51 АНТИГЕНА ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(57) Штамм микроорганизма 21/3.32/51 - продуцент рекомбинантного 51 антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии при разработке Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии при разработке методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Важным аспектом предотвращения распространения лейкоза крупного рогатого скота является серологическая диагностика болезни. Основными диагностическими методами в программах по профилактике и ликвидации болезни считаются реакция иммунодиффузионной приципитации и иммуноферментный анализ. Широкое применение диагностических тест-систем инъецирует разработку все более высокоспецифичных компонентов используемых в тест-системах. Известно,что тест-системы,основанные на использовании нативных белков вируса лейкоза крупного рогатого скота, имеют низкую специфичность и часто дают перекрестную реакцию с антителами к близкородственным вирусам. Основная причина такой низкой специфичности заключается в зараженности линии культур клеток различными вирусами. Технология,основанная на использовании генетически трансформированного штамм-продуцента,в отличие от традиционных технологий, позволяет получать высокоочищенные стабильные препараты рекомбинантного гликопротеина 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота. Развитие методов генетической инженерии и получение рекомбинантных антигенов различных возбудителей инфекционных болезней животных и человека привело к радикальному улучшению методов диагностики. Стало ясно,что использование для иммунологических анализов нативных антигенов, из-за содержания примесных компонентов,приводит к неоднозначности получаемых результатов,и потому такие компоненты тест-систем должны быть заменены искусственными специфическими антигенами. Получение таких антигенов на основе рекомбинантных технологий приобретает все большую популярность среди исследователей. Популярность рекомбинантных антигенов связана с их высокими диагностическими характеристиками. Известно, что тест-системы,основанные на использовании нативных белков вируса лейкоза крупного рогатого скота, имеют низкую специфичность и часто дают перекрестную реакцию с антителами против других гомогенных вирусов. Основная причина такой низкой специфичности заключается в зараженности линии культур клеток различными вирусами. Более того,технология,основанная на использовании генетически трансформированного штаммпродуцента,в отличие от традиционных технологий, позволяет получать высокоочищенные стабильные препараты рекомбинантных антигенов вируса лейкоза крупного рогатого скота. Патентный поиск выявил патент США 8529909 В 2 от 10 сентября 2013 года 51. Патент описывает метод получения и 2 очистки 51 антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота из клеточной линии культивированной в питательной среде содержащей фетальную сыворотку телят. Следующим субъектом патента является описание способа применения полученного антигена в реакции иммунодиффузии и иммуноферментном анализе. Другой патент США 2011/0250624 А 1 от 13 октября 2013 года 51, также описывает способ применения,получения и очистки гликопротеина вируса лейкоза крупного рогатого скота из клеточной линиивыращенной полностью в безсывороточной среде. Патент 91/00105 от 10 января 1991 года описывает получение вакцины против лейкоза крупного рогатого скота. Рекомбинантный вирус включает поверхностный гликопротеин 51 вируса,приводящий к формированию вируснейтрализующих антител у вакцинированных животных. Гликопротеин в рекомбинантном вирусе формировал нативную конфигурацию и содержал все необходимые антигенные эпитопы , и Н характерные для 51 антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота. Обзор литературных данных выявил работу по экспрессии гликопротеина вируса лейкоза крупного рогатого скота с на основе баколовирусной векторной системы. Для этого, ген гликопротеина(51) с ее сигнальной последовательностью в 33 аминокислоты, дополнительно представленной на-конце, встраивали в бакуловирусный вектор. Секретируемый 51 был использован в качестве антигена в иммуноферментном анализе и применялся для обнаружения антител против вируса лейкоза крупного рогатого скота. Сравнительное исследование продемонстрировало преимущество использования рекомбинантного 51 антигена в иммуноферментном анализе (., .,.,(51)//. - 2004. - .11. - .147-151). Задачей изобретения является получение штамма, продуцента рекомбинантного 51 антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота. Штамм получали следующим образом. Поиск нуклеотидной последовательности 51 антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота проводили с использованием баз данныхи. Анализ первичных структур проводился с использованием пакета программ 9.0. В работе использовались хемокомпетентные штаммы Е.5 (, ) и электрокомпетентные клетки Е.штамма 21(3), плазмидные вектора (, ) и рЕТ 32 а . Клетки Е.выращивали на жидкой и плотной питательных средах . Генетическая конструкция создавалась в условиях. Для этого, предварительно были синтезированы олигомеры размером 60 олигонуклеотидов, для синтеза полноразмерного гена 51 антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота с 4 концевыми сайтами рестрикции. Полученные гены кодон оптимизированы для достижения максимальной экспрессии в Сборку гена осуществляли 2 раундовой полимеразной цепной реакцией с использованиемполимеразы. Фракционирование продуктов полимеразной цепной реакции осуществляли методом электрофореза в 1 легкоплавком агарозном геле. Электрофорез проводили при комнатной температуре в трис-ацетатном буфере (0,04 М трисацетат 8,1, 0.002 М ЭДТА) с содержанием 0,5 мкг/мл бромистого этидия, при напряженности электрического поля 10 В/см в течение 30-60 мин. Фрагмент ДНК выделяли из геля используя набор 70(, США). Для клонированием синтезированного гена 51 антигена в вектор -, предварительно к гену достраивали концевые А нуклеотиды используя -полимеразу. К 2 мкл раствора ДНК добавляли 23 мкл - для -полимеразы и 0,5 мкл-полимеразы,перемешивали,консолидировали содержимое на дно пробирки и инкубировали смесь при 72 С в течение 20 минут. Далее к 25 мкл реакционной смеси добавляли 25 мкл воды . Добавляли 40-50 мкл фенола и тщательно перемешивали содержимое пробирки встряхиванием на вортексе до образования однородной суспензии. Центрифугировали при 10000 об/мин - 5 минут. Полученную водную фазу перенести в новую пробирку, добавляли 1 мкл декстрана и 5 мкл 5 М хлорида натрия. Капли консолидировали на дно пробирки и добавляли 170 мкл этанола 96. Выдерживали 10 минут при - 20 С и центрифугировали 1000 об/минуту в течение 10 минут. Надосадочную жидкость удаляли, к осадку вносили 50 мкл 96 этанола и центрифугировали при 10000 об/минуту в течение 1 минуты. Надосадочную жидкость удаляли, 10 минут просушивали осадок для полного удаления этанола,осадок растворяли в 5 мкл чистой водыдля лигазных реакций. Для клонирования полученного гена в векториспользовали набор по инструкции производителя. Лигирование проводили в течение ночи при 4-5 С с использованием суховоздушного настольного термостата. Трансформацию компетентных клеток . 5 проводили в соответствии с протоколом производителя. Предварительно приготовилиагар с ампицилином,и- . Эффективность трансформации определяли использованием в качестве контроля 19, входящий в комплект. Чашки Петри инкубировали в течение ночи при 37 С. Полученные белые колонии тестировались на полимеразной цепной реакцией с использованием М 13 праймеров. Длина получаемого ПЦР продукта составляла 750 пар оснований. Отобранные колонии пересевались в 5 мл среды ампицилин и после достижения оптической плотности 6000.8 пересевались в 200 мл средыи культивировались при 37 С в течении ночи при постоянной аэрации. После культивирования клетки собирались центрифугированием при 5000 об/минуту в течение 20 минут при 4 С. Очистку плазмиды проводили с использованием набора. Первичную структуру ДНК определяли по методус использованием наборовна автоматических анализаторах ДНК 3100( , США). Гидролиз полученной плазмидной ДНК и рЕТ 32 а проводили с использованием эндонуклеаз рестрикциии(, Литва) в соответствующих буферных и температурных условиях согласно рекомендациям производителей. Разделение продуктов гидролиза проводили электрофорезом в 1 легокоплавкой агарозе. Предварительно в рестрикционную смесь добавляли 1 мкл декстрана и 5 мкл 5 М хлорида натрия. Капли консолидировали на дно пробирки и добавляли 170 мкл этанола 96. Выдерживали 10 минут при 20 С и центрифугировали 1000 об/минуту в течение 10 минут. Надосадочную жидкость удаляли, к осадку вносили 50 мкл 96 этанола и центрифугировали при 10000 об/минуту в течение 1 минуты. Надосадочную жидкость удаляли, 10 минут просушивали осадок для полного удаления этанола,осадок растворяли в 5 мкл чистой воды . Электрофорез проводили при комнатной температуре в трис-ацетатном буфере (0.04 М трисацетат 8.1, 0.002 М ЭДТА) с содержанием 0.5 мкг/мл бромистого этидия, при напряженности электрического поля 10 В/см в течение 30-60 мин. Фрагменты ДНК из геля выделяли используя набор 70(, США). Для лигирования фрагментов ДНК использовали Т 4 ДНК лигазу (, ). Лигирование проводили в строгом соответствии с инструкцией производителя. Реакцию проводили при 4 С в течение ночи. Компетентные клетки Е.штамма 21(3) трансформировали полученными экспрессионными плазмидами,трансформанты высевали на селективную среду с ампициллином (100 мкг/мл). Выросшими колониями инокулируют 100 мл среды(Ар 100 мкг/мл), культивировали до 6000.8 при 37 С. Затем индуцировали экспрессию гена добавлениемдо концентраций 0,2 мМ. После добавления индуктора температуру культивирования снижали до 28 С и культивировали индуцированную культуру в течение 4-5 часов. После этого клетки собирали центрифугированием (3000 15), промывали небольшим объемом охлажденногои 3(Россия),следуя рекомендациям производителя прибора. Полученный лизат осветляли центрифугированием (40 000 45). Клетки культивировали в среде , в течение 24 часов при 37 С в анаэробных условиях. На твердых питательных средах бактериальные клетки образуют крупные, выпуклые, круглой правильной формы,полупрозрачные колонии мягкой консистенции. В жидкой питательной среде клетки образуют равномерное помутнение. Образуют индол, не образует сероводород. Штамм микроорганизма представляют собой прямые грамотрицательные палочки размером 1,1-1,5 х 2,0-6,0 мкм, концы палочек закруглены, спор и капсул не образуют. Компетентные клетки Е.культивировали в 1000 мл среды(триптона - 10 г, дрожжевого экстракта - 5 г,- 5 г, дистиллированная вода до 1000 мл, 50 мкг/мл канамицина, рН 7,5) при 37 С, в течение 18-24 часов до 6000,8. Затем для индуцирования экспрессии гена добавляли изопропил-,-тиогалактопиранозид в концентраций 0,2 мМ. После добавления индуктора клетки культивировали при 30 С и в течение 6 часов. Клетки Е. , содержавшие наработанный химерный рекомбинантный белок, осаждали центрифугированием при 3000 в течение 20 минут,осадок промывали 1/3 объема физраствора,центрифугировали при 3000 20 минут и ресуспендировали в 10-30 мл буфера для металлаффинной хроматографии(25 мМ натрийфосфатный буфер 7.4, 400 мМ , 200 имидазол). Клетки разрушали ультразвуком (22,4 раза по 20 секунд), нерастворимую фракцию отделяли центрифугированием при 50000 в течение 45 минут. Нерастворимую фракцию (осадок) ресуспендировали в 10 мл 25 мМ буфера для металлаффинной хроматографии с 8 М мочевиной,инкубировали 1 час на магнитной мешалке, затем центрифугировали при 50000 в течение 45 минут. Полученный таким образом осветленный лизат фильтровали через нейлоновый фильтр (диаметр пор 0.45 мкм) и подвергали металл-аффинной хроматографии. Рекомбинантный белок очищали на колонке(, США). Элюцию проводили буфером (25 мМ натрий-фосфатный буфер 7.4, 400 мМ , 200 имидазол, 8 М мочевина). Ренатурацию рекомбинантного белка проводили с помощью диализа против 300-кратного объема 25 мМ натрий-фосфатного буфера 7.25 с 300 мМ. Ренатурированный белок анализировали денатурирующим электрофорезом в 15 ПААГ. Электрофорез осуществляли по методу, на аппарате для вертикального электрофореза (, США) с использованием трис-глицинового буфера. Для приготовления 10 разделяющего полиакриламидного геля смешивали 10 мл 30 раствора мономеров (28,5 г акриламида, 1,5 г бисакриламида, дистиллированная вода до 100 мл),7,5 мл разделяющего буфера (1,5 М Трис НС 1, рН 4 8,8), 12 мл дистиллированной воды. После смешивания растворов проводили дегазацию раствора и добавляли 150 мкл 10 раствора персульфата аммония, 0,3 мл 10 додецилсульфата натрия,10 мкл(ТЕМЕД). После добавления ТЕМЕД, гель вносили в камеру и аккуратно наслаивали дистиллированную воду. Гель оставляли на 45 минут для полимеризации. Концентрирующий гель готовили смешиванием 1,33 мл 30 раствора мономеров, 2,5 мл концентрирующего буфера (0,5 М Трис НС 1, рН 6,8), 6,1 мл дистиллированной воды. После перемешивания компонентов проводили дегазацию раствора и добавляли 50 мкл 10 раствора персульфата аммония, 0,1 мл 10 раствора додецилсульфата натрия, 5 мкл ТЕМЕД. Раствор концентрирующего геля наслаивали на подготовленный разделяющий гель, вставляли гребенку и оставляли на 45 минут для полимеризации. Приготовленную полиакриламидную пластинку закрепляли в камере для электрофореза и заливали трис-глициновый буфер (0,025 М трис рН-8,3, 0,192 М глицин, 0,1 додецилсульфата натрия). Преэлектрофорез проводили при силе тока 20 мА в течение 30 минут. Препараты вирусных антигенов разводили в буфере для образцов (0,125 М трисрН-6,8, 4 додецилсульфат натрия, 20 глицерин,10 меркаптоэтанол) в соотношении 11. Смесь выдерживали при 100 С в течение 3 минут. В лунки геля вносили по 10 мкл приготовленного образца. Электрофорез проводили в стадии концентрирующего геля при 10 мА, в стадии разделяющего геля при 20 мА. Белковые полосы выявляли с помощью окраски электрофореграммы Кумасси -250. Оценку электрофореграммы проводили на гель документирующей системе(, США). Определение концентрации очищенного рекомбинантного антигена проводили по методу Брэдфорда. В лунки первого ряда вносили по 0,1 мл пробы образца очищенного антигена, контролем служил бычий сывороточный альбумин в концентрации 1 мг/мл. В лунки следующих рядов вносили по 0,05 мл забуференного раствора. Опытные и контрольные пробы белка раститровывали в объеме 0,05 мл. В каждую лунку вносили по 0,05 мл реактива Брэдфорда и учитывали результат на спектрофотометре при длине волны 492 нм. Штамм микроорганизма 21/3.232/51 продуцент рекомбинантного 51 антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота депонирован и хранится в ДГП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан (010000, г. Астана, ул. Ч. Валиханова,43) под регистрационным номером 21/3.22/51 представляют собой прямые грамотрицательные палочки размером 1,1-1,5 х 2,06,0 мкм, концы палочек закруглены, спор и капсул не образуют. Культуральные свойства. Клетки культивируют в среде , в течение 24 часов при 37 С в анаэробных условиях. На твердых питательных средах бактериальные клетки образуют крупные,выпуклые,круглой правильной формы,полупрозрачные колонии мягкой консистенции. В жидкой питательной среде клетки образуют равномерное помутнение. Образуют индол, не образует сероводород. Продуктивность штамма. Для получения максимального уровня полезного продукта применяют жидкую среду , инкубирование при 37 С, в течение 18-24 часов до 6000,8. После добавляют 0,2 мМ изопропил-,тиогалактопиранозид) и инкубируют при 30 С в течение 6 часов. Максимальный концентрация рекомбинантного 1 антигена составляет 500 мкг/мл. Характеристика полезного продукта. Молекулярная масса рекомбинантного 51 антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота синтезируемый штаммом составляет 45 кДа. Методы оценки Продукция неструктурного белка вируса ящура определяется электрофорезом в СДС полиакриламидном геле ( 4 // . - 1970. - . 27. - . 680-685). Специфичность полученных антигенов определяется в иммуноферментном анализе. Контаминация. Контаминантов в клетках включая, бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы не обнаружено. Криоконсервация. Криоконсервация с использованием , 20 глицерина, 10 сахарозы,10 поливинилпиролидона, концентрация клеток 109 КОЕ/мл. Для лиофилизации используют защитную среду обезжиренное молоко в соотношении 11,концентрация клеток 109 КОЕ/мл. Лиофильно высушенные образцы,при температуре хранение 4, минус 20, 40 и 80 в течение 10 лет. Криоконсервированные образцы,при температуре хранение при -80 С, в течение 10 лет. Среда(4 С) на скошенном агаре (пересев 1 р./3 мес.) и под вазелиновым маслом в высоком столбике (пересев 1 р./г.) Условия размораживания. Замороженную ампулу быстро помещают в водяную баню при 37 С. После размораживания суспензию клеток переносят в стерильную пробирку, содержащую 10 мл жидкой среды(триптона - 10 г,дрожжевого экстракта - 5 г,- 5 г,дистиллированная вода до 1000 см 3, 50 мкг/см 3 ампициллина, рН 7,5) и инкубируют при 37 С, в течение 18-24 часов. Число жизнеспособных клеток после размораживания не менее 85. Леофильно высушенные образцы разводят в 1 мл стерильного физиологического раствора и пересевают в стерильную жидкую среду(триптона - 10 г, дрожжевого экстракта - 5 г,5 г, дистиллированная вода до 1000 см 3, 50 мкг/см 3 ампициллина, рН 7,5) и инкубируют при 37 С, в течение 18-24 часов. Штамм микроорганизма 21/3.22/51 - продуцент рекомбинантного 51 антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота используют следующим образом. Пример. Компетентные клетки Е.штамма 21/3.22/51 культивируют в 1000 мл среды(триптона - 10 г, дрожжевого экстракта - 5 г, - 5 г, дистиллированная вода до 1000 см 3,50 мкг/см 3 ампициллина, рН 7,5), при температуре 37 С до 6000.8. Затем индуцируют экспрессию гена добавлениемв концентрации 0,1 мМ. После добавления индуктора клетки культивируют при 30 С и в течение 8 часов. Клетки Е. , содержавшие наработанный химерный рекомбинантный белок, осаждают центрифугированием при 3000 в течение 20 минут,осадок промывают 1/3 объема физраствора,центрифугируют при 3000 20 минут и ресуспендируют в 10-30 мл буфера для металлаффинной хроматографии(25 мМ натрийфосфатный буфер 7,4, 400 мМ , 20 имидазол). Клетки разрушают ультразвуком (22,4 раза по 20 секунд), нерастворимую фракцию отделяют центрифугированием при 50000 в течение 45 минут. Нерастворимую фракцию(осадок) ресуспендируют в 10 мл 25 мМ буфера для металл-аффинной хроматографии с 8 М мочевиной,инкубируют 1 час на магнитной мешалке, затем центрифугируют при 50000 в течение 45 минут. Полученный таким образом осветленный лизат фильтруют через нейлоновый фильтр (диаметр пор 0.45 мкм) и подвергают металл-аффинной хроматографии. Рекомбинантный белок очищают на колонке(, США). Элюцию проводят буфером (25 мМ натрий-фосфатный буфер 7,4, 400 мМ , 20 имидазол, 8 М мочевина). Ренатурацию рекомбинантного белка проводят с помощью диализа против 300-кратного объема 25 мМ натрий-фосфатного буфера 7,2 с 300 мМ . Ренатурированный белок анализируют денатурирующим электрофорезом в 15 ПААГ. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм микроорганизма 21/3.22/51,депонирован в ДГП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан под регистрационным номером 0631, продуцент рекомбинантного 51 антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота.