Способ получения латексного диагностикума для постановки реакции латекс-агглютинации

(51) 01 33/569 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ достигается тем, что при разработке способа в качестве буферного раствора для сорбции антигенов на полимерных сорбентах используют фосфатнобуферный раствор с 6,8-7,2, в качестве носителя используется полиэтилен с размером гранул 0,5 мм,а сорбция антигена проводится в течение 1 часа при комнатной температуре и непрерывном перемешивании реакционной смеси. Предлагаемый способ получения латексного диагностикума для постановки реакции латексагглютинации является новым и достаточно совершенным, т.к. синтетические материалы на основе полиэтилена обладают высокой сорбционной способностью и стойкостью при хранении. Использование предлагаемого способа позволит использовать полиэтилен в качестве полимерного носителя антигенов различной природы при конструировании иммунодиагностических тестсистем для проведения реакции агглютинации латекса с целью обнаружения антигенов и антител в исследуемой пробе.(72) Кухар Елена Владимировна Никитин Евгений Борисович Парийчук Оксана Дорофеевна(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛАТЕКСНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ЛЕТЕКС-АГГЛЮТИНАЦИИ(57) Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, в частности к способу получения латексного диагностикума для постановки реакции латексагглютинации. Технической задачей изобретения является разработка способа получения латексного диагностикума для постановки реакции латексагглютинации с целью использования в серологической диагностике трихофитии сельскохозяйственных животных,которая 24631 Изобретение относится к области иммунологии и биотехнологии, в частности к способу получения латексного диагностикума для постановки реакции латексагглютинации. Известен способ получения латексного диагностикума для постановки реакции латексагглютинации, который заключается в том, что полимерную суспензию центрифугируют, доводят дистиллированной водой концентрацию полимерной суспензии до 0,5 по сухому остатку полимера, смешивают в равных объемах водные растворы вирусного антигена в инфекционном титре 6,5 ТЦД/50 мл (Тканевых Цитопатических Доз) и 0,5-1,0-ную полимерную суспензию, помещают в термостат при 36-38 С на 4-6 ч. Затем к общему объему суспензии добавляют водный раствор человеческого сывороточного альбумина в концентрации 0,07-0,15, инкубируют при 4-8 С в течение 11-13 часов, суспензию отмывают и доводят концентрацию диагностикума фосфатно-солевым буфером 7,2-7,4 до 0.1-0,3. Патент РФ 2270449, МПК 01 33/531, опубл. 20.02.2006. Известен способ приготовления лептоспирозного диагностикума для постановки реакции латексагглютинации, в котором в качестве микросфер латекса используют карбоксилированные частицы,активированные карбодиимидом. При этом антитела к лептоспирам серогруппиадсорбируют на упомянутых частицах латекса путем обработки в ультразвуковой бане в течение 30,5 мин с последующим встряхиванием при температуре 41 С и дальнейшей инкубации смеси при этой же температуре. Затем продукты адсорбции отмывают дистиллированной водой центрифугированием и к полученному осадку добавляют физиологический раствор до первоначального объема Патент РФ 2177617,МПК 01 33/567, 01 33/546, опубл. 27.12.2001. Известен способ получения диагностикума для обнаружения дифтерийного токсина. В качестве носителя используют полимер, полученный методом анионной полимеризации мономера акрилового альдегида в присутствии инициатора полимеризации едкого натрия и представляющий окрашенные монодисперсные частицы сферической формы диаметром 20,5 мкм с реакционными альдегидными группами на поверхности частиц в количестве 1,3-1,6 мкмоль/г носителя. Носитель отмывают 0,1 М карбонатным буферным раствором с 9,0-9,2, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут. Иммобилизацию проводят суспензированием отмытого носителя в 0,1 М карбонатном буфере,9,0-9,2 и добавлением к нему дифтерийного антитоксического иммуноглобулина, оставляют для контакта в течение двух часов при 20 С, охлаждают до 7 С и выдерживают 16-18 часов, стабилизацию проводят введением в суспензию 1 раствора желатозы на 0,9 растворе хлорида натрия, оставляют при перемешивании при 20 С в течение двух часов. Патент РФ 2282192, МПК 01 33/569,0133/543, опубл. 20.08.2004. 2 Известен иммунодиагностикум на основе полистирольного латекса. Иммунодиагностикум разработан на основе модифицированного полистирольного латекса, содержащего в качестве балластного белка -казеин коровьего молока. При этом -казеин коровьего молока, предназначенный для насыщения вакантных центров связывания,содержится в равных объемах с полистирольным латексом при концентрации -казеина 0,4 мг/мл. Патент РФ 2231366, МПК А 61 К 51/08, 01 33/569, опубл. 27.06.2004. Более близкого технического решения прототипа обнаружить не удалось. Технической задачей изобретения является разработка способа получения латексного диагностикума для постановки реакции латексагглютинации с целью использования в серологической диагностике трихофитии сельскохозяйственных животных,которая достигается тем, что при разработке способа в качестве буферного раствора для сорбции антигенов на полимерных сорбентах используют фосфатнобуферный раствор с 6,8-7,2, в качестве носителя используется полиэтилен с размером гранул 0,5 мм,а сорбция антигена проводится в течение 1 часа при комнатной температуре и непрерывном перемешивании реакционной смеси. Пример 1. Подбор оптимального полимерного сорбента для сорбции, буферного раствора и РН среды. Перед началом исследований готовят буферные растворы с различным значением 0,1 М карбонатно-бикарбонатный буферный раствор 9,2-9,4, глициносолянокислый буферный раствор 4,2-4,6, фосфатно-буферный раствор 6,8-7,2 раствор яичного белка с концентрацией 40 мг/мл. В колбы наливают по 2 мл раствора белка альбумина и по 2 мл буферного раствора в колбы 1,4, 7, 10 карбонатно-бикарбонатный буферный раствор, в колбы 2, 5, 8, 11 - глициносолянокислый буферный раствор и в колбы 3, 6, 9, 12 фосфатно-буферный раствор. Содержимое колб тщательно перемешивают и с помощью фотоколориметра определяют оптическую плотность белкового раствора при длине волны 397 нм. После этого в каждую колбу добавляют по 0,75 г полимера в колбы 1, 2, 3 -полистирол, в колбы 4, 5, 6 - полиметилметакрилат в колбы 7, 8, 9 поливинилхлорид, в колбы 10, 11, 12 полиэтилен. Полимер используют в виде гранул размером 0,5 мм. Сорбцию белка полимерным сорбентом производят в течение 1 часа при комнатной температуре и непрерывном перемешивании реакционной смеси. По истечении одного часа сорбент декантируют и измеряют оптическую плотность надосадка. Полученные результаты оптической плотности раствора яичного альбумина с буферным раствором до и после сорбции различными полимерными носителями представлены в таблице 1. 24631 Таблица 1 Оптическая плотность яичного альбумина с буферным раствором Полимерный сорбент Как видно из таблицы, наилучшая сорбция яичного альбумина полистиролом происходит в присутствии фосфатно-буферного раствора,полиметилметакрилатом-карбонатно-бикарбонатного раствора, поливинилхлоридом - фосфатнобуферного раствора, полиэтиленом - фосфатнобуферного раствора. Это показывает что, лучший результат сорбции белковых препаратов различными полимерными носителями протекает в среде фосфатно-буферного раствора с 6,8-7,2. Лучшие результаты сорбции выявлены на полимерных сорбентах,изготовленных из полиэтилена. Таким образом, установлено, что полиэтилен обладает сорбционными способностями по отношению к белковым препаратам, причем наилучшая сорбция яичного альбумина полиэтиленом протекает в среде фосфатнобуферного раствора. Оптическая плотность яичного альбумина до сорбции после сорбции полимером полимером 0,020 0,010 0,020 0,0075 0,0175 0,010 0,020 0,010 0,0175 0,0075 0,020 0,010 0,0175 0,010 0,020 0,005 0,0175 0,005 0,025 0,005 0,025 0,0075 0,020 0,005 0,020 0,01 0,020 0,0075 0,025 0,01 0,02 0,01 0,0175 0,0075 0,02 0,01 0,0175 0,01 0,0175 0,005 0,02 0,01 0,0175 0,01 0,0175 0,01 0,02 0,0075 0,025 0,010 0,020 0,005 0,025 0,005 0,097 0,064 0,078 0,092 0,062 0,049 0,079 0,095 0,088 0,075 0,104 0,071 0,085 0,052 0,08 0,062 0,05 0,042 Пример 2. Стандартизацию антигенов дерматомицетов проводят по содержанию основного вещества белков и углеводов. В опыте используют антигены дерматомицетов полисахаридной и белковой природы, полученные,соответственно полисахаридный по методу- (1965) и белковый - по методу. (1979). Определение концентрации белка в антигенах проводят по Бредфорду. Для этого в лунки первого ряда пластиковой 96-луночной планшеты вносят по 100 мкл пробы белка неизвестной концентрации и бычий сывороточный альбумин в концентрации 1 мг/см 3 в качестве контроля. В лунки следующих рядов вносят по 50 мкл фосфатного буфера. Опытные и контрольные пробы белка титруют в объме 50 мкл. В каждую лунку вносят по 50 мкл реактива Бредфорда и учитывают результат. 24631 Определение концентрации углеводов в растворе антигена проводят сернокислотным методом готовят калибровочную шкалу стандартного раствора глюкозы и растворы исследуемого антигена,внося в пробирки по 200 мкл антигена и дистиллированной воды. Вносят во все пробирки(стандартные и опытные) по 200 мкл 5 раствора фенола, затем по 1 см 2 концентрированной серной кислоты. Пробирки оставляют на 10 минут в темном месте, затем на 10 минут в водяной бане при температуре 25 - 30 С, после чего проводят учет реакции,сравнивая опытные данные с калибровочной шкалой стандартного раствора глюкозы. Результаты определения концентрации белков и углеводов в растворах антигенов приведены в таблицах 2, 3. Таблица 2 Концентрация белков и углеводов в антигенах дерматомицетов Наименование антигена Т.Т.Т.Т.Т.Т.Т.Т. Концентрация белков Концентрация углеводов(мкг/мл) Белковый антиген по. (1979) 300 125 125 30 250 30 250 30 Полисахаридный антиген по - (1965) 1000 7 500 1,5 500 1,5 1000 3 Пример 3. Определение сорбционной способности полиэтилена связывать антигены различной природы в присутствии фосфатнобуферного раствора. В опыте используют антигены дерматомицетов полисахаридной и белковой природы, а также полиэтилен в качестве полимерного сорбента. В десять пронумерованных колб наливают по 3 мл буферного раствора и по 3 мл раствора антигена. В качестве буферного раствора используют фосфатно-буферный раствор. Содержимое колб тщательно перемешивают, определяют оптическую плотность раствора при длине волны 397 нм. После чего в каждую колбу добавляют по 0,75 г полимерного сорбента, в качестве которого используют полиэтилен. Сорбцию антигенов полимерным сорбентом проводят в течение 1 часа при комнатной температуре и непрерывном перемешивании реакционной смеси, по истечении чего сорбент декантируют и измеряют оптическую плотность надосадка по описанной выше методике. Результаты измерения оптической плотности раствора антигена с буферным раствором до сорбции и после сорбции полимером представлены в таблице 4. Таблица 4 Оптическая плотность раствора антигенов с буферным раствором Оптическая плотность раствора антигена После сорбции До сорбции полимером полимером Белковый антиген по. (1979) Т.0,0910,0040 Т.0,0470,0026 Т.0,0410,0027 Т.0,0480,0016 Полисахаридный антиген по - (1965) Т.0,0580,0036 Т.0,1610,0030 Т.0,0600,0076 Т.2 0,0700,0020 В результате проведенных исследований установлено,что полиэтилен обладает сорбционными способностями по отношению к антигенам различной природы. Отмечено, что полиэтиленовый носитель лучше связывается с 4 полисахаридными антигенами дерматомицетов. Остальные антигены также связываются с носителем, за исключением белковых антигенов дерматомицетов Т.(3), Т.( 4), полученных по методу по.(1979). Полученные результаты показали, что антигены сорбируются на полиэтилене и данный синтетический материал можно использовать в качестве сорбента антигенов. Таким образом, синтетические материалы на основе полиэтилена обладают высокой сорбционной способностью, следовательно, их можно использовать для конструирования иммунодиагностических тест-систем, позволяющих проводить реакцию агглютинации латекса для обнаружения антигенов и антител в исследуемой пробе. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения латексного диагностикума для постановки реакции летексагглютинации,заключающийся в использовании в качестве буферного раствора для сорбции антигенов на полимерных сорбентах фосфатно-буферного раствора с 6,8-7,2 и сорбции антигена с носителем в течение 1 часа при комнатной температуре и непрерывном перемешивании реакционной смеси, отличающийся тем, что в качестве носителя используется полиэтилен с размером гранул 0,5 мм.