Способ получения препарата КФ-F1 и применение его в качестве иммунностимулирующего средства

(51) 61 36/062 (2006.01) 61 37/04 (2006.01) 12 1/14 (2006.01) 12 1/77 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ быть использовано в качестве иммуностимулирующего средства. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении препарата,обладающего иммуностимулирующими свойствами. Иммуностимулирующее средство, достигается тем,что получение препарата КФ(концентрированный фильтрат),обладающего иммуностимулирующим действием, проводят путем культивирования штамма продуцента в питательной среде с последующим отделением мицелия, в качестве продуцента используют штамм- 166, культивируют на жидкой модифицированной среде Чапека, дополненной картофельным отваром,мицелий отделяют фильтрацией, фильтрат концентрируют в два раза под вакуумом,проводят дополнительную мембранную фильтрацию, полученный фильтрат концентрируют в пять раз и выдерживают на холоду до отделения высокополимерных фракции в виде осадка, который отделяют повторной фильтрацией,прозрачный очищенный раствор культурального фильтрата высушивают досуха под вакуумом,полученный препарат используют в качестве биологически активного продукта, обладающего иммуностимулирующим действием.(72) Сапко Ольга Александровна Михалев Александр Николаевич Утарбаева Айжан Шарельевна Кунаева Рауза Минлиахмедовна Колбай Ибрагим Сулейменулы Тобагабыл Ляззат Толепбергеновна Байдалинов Арслан Исаханович Джакибаева Гульнар Тураровна(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А.Айтхожина Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Центр биологических исследований Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА КФ 1 И ПРИМЕНЕНИЕ ЕГО В КАЧЕСТВЕ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕГО СРЕДСТВА(57) Способ получения препарата КФ- и применение его в качестве иммуностимулирующего средства относится к области медицины и может Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в качестве иммуностимулирующего средства. Известен способ получения биологически активного вещества,обладающего иммуностимулирующим действием из грибаштамма 213107 (Патент СССР 944491, кл. А 61 39/00, 1977 г.). Недостатком данного способа является то, что метод требует длительного времени для исполнения и значительных трудозатрат, расхода дорогостоящих растворителей и экстрагентов. Задачей изобретения является получение эффективного и дешевого иммуностимулирующего средства из гриба рода . Поставленная задача достигается тем, что получение препарата КФ-,обладающего иммуностимулирующим действием, проводят путем культивирования штамма продуцента в питательной среде с последующим отделением мицелия, в качестве продуцента используют штамм 166, культивируют на жидкой модифицированной среде Чапека, дополненной картофельным отваром,мицелий отделяют фильтрацией,фильтрат концентрируют в два раза под вакуумом, проводят дополнительную мембранную фильтрацию,полученный фильтрат концентрируют в пять раз и выдерживают на холоду до отделения высокополимерных фракции в виде осадка, который отделяют повторной фильтрацией, прозрачный очищенный раствор культурального фильтрата высушивают досуха под вакуумом, полученный препарат используют в качестве биологически активного продукта обладающего иммуностимулирующим действием. Штамм гриба . - 166 используют для испытания средств защиты растений, резистентности различных сортов картофеля к фузариозам и др. Штамм - 166 был получен из Республиканской коллекции микроорганизмов РК. Культуру штамма гриба .- 166,культивируют на жидкой питательной среде в конической плоскодонной колбе объемом 500 см 3 с содержанием питательной среды около 150 см 3 в термостате при температуре 25-27 С без перемешивания. Пример 1. Культуру штамма гриба . 166, культивировали на жидкой модифицированной среде Чапека 2, дополненной картофельным отваром из расчета 1 часть отвара на 4 части среды, в конической плоскодонной колбе объемом 500 см 3 с содержанием питательной среды около 150 см 3 в термостате при температуре 25-27 С без перемешивания в течение 17-18 дней. Пример 2. Среду культивирования гриба отделяли от мицелия с помощью фильтрации через бумажный складчатый фильтр. Культуральный фильтрат концентрировали в роторном испарителе при температуре 38-40 С при разряжении 8 кПа до половины первоначального объема. Полученный концентрат фильтровали с помощью вакуум фильтрационной установки через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм. Фильтрат концентрировали в 2 роторном испарителе при температуре 38-40 С при разряжении 8 кПа до 1/5 объема. Концентрированный фильтрат выдерживали в холодильнике при температуре 4 С в течение 48 часов. Выпавший осадок отделяли с помощью фильтрации через бумажный складчатый фильтр. Получали прозрачный раствор,который высушивали досуха под вакуумом. Получали препарат КФ-. Пример 3. Клеточный иммунитет определяли по способности мышей к индукции реакции гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ) к эритроцитам барана (ЭБ). Для испытания влияния КФ- на клеточный иммунитет было сформировано 5 групп беспородных белых мышей - самцов средним весом 25 грамм. Во время всего эксперимента животные находились на одинаковом рационе питания. Введение испытуемого вещества осуществляли в одно и то же время суток (утром). Пример 4. 47 мг препарата растворили в 10 см 3 физиологического раствора. Получили раствор для исследования, 0,2 см 3 которого содержало дозу препарата равную 1/10 50 для белых мышей, а 0,1 см 3 -дозу препарата равную 1/20 50 для белых мышей. Доза 50 для препарата была определена заранее на предварительном этапе и составила для белых мышей 375 мг на килограмм живого веса мыши. Пример 5. Животным первой группы в количестве 7 мышей вводили внутрибрюшинно сенсибилизирующую дозу эритроцитов барана в виде 5 суспензии в физиологическом растворе в объеме 0,2 см 3. Для выявления влияния препарата на процесс образования сенсибилизированных Т лимфоцитов мышам первой опытной группы одновременно с сенсибилизирующей дозой эритроцитов барана вводили внутрибрюшинно по 0,2 см 3 раствора препарата КФ- из примера 4 (1/10 50). На 5-й день после сенсибилизации всем животным в подошвенную подушечку стопы вводили разрешающую дозу эритроцитов барана в виде 10 суспензии в физиологическом растворе в объеме 0,1 см 3. В качестве контроля всем животным в те же сроки в контралатеральную лапку в таком же объеме вводили физиологический раствор. Пример 6. Животным второй группы в количестве 7 мышей вводили внутрибрюшинно сенсибилизирующую дозу эритроцитов барана в виде 5 суспензии в физиологическом растворе в объеме 0,2 см 3. Для выявления влияния препарата на стадию взаимодействия лимфоцитов-эффекторов с сенсибилизирующим антигеном мышам второй опытной группы одновременно с разрешающей дозой эритроцитов барана вводили внутрибрюшинно по 0,2 см 3 раствора препарата КФ- из примера 4(1/10 50). На 5-й день после сенсибилизации всем животным в подошвенную подушечку стопы вводили разрешающую дозу эритроцитов барана в виде 10 суспензии в физиологическом растворе в объеме 0,1 см 3. В качестве контроля всем животным в те же сроки в контралатеральную лапку в таком же объеме вводили физиологический раствор. Пример 7. Животным третьей группы в количестве 8 мышей вводили внутрибрюшинно сенсибилизирующую дозу эритроцитов барана в виде 5 суспензии в физиологическом растворе в объеме 0,2 см 3. Для выявления влияния препарата на процесс образования сенсибилизированных Т лимфоцитов мышам третьей опытной группы одновременно с сенсибилизирующей дозой эритроцитов барана вводили внутрибрюшинно по 0,1 см 3 раствора препарата КФ- из примера 4 (1/20 50). На 5-й день после сенсибилизации всем животным в подошвенную подушечку стопы вводили разрешающую дозу эритроцитов барана в виде 10 суспензии в физиологическом растворе в объеме 0,1 см 3. В качестве контроля всем животным в те же сроки в контралатеральную лапку в таком же объеме вводили физиологический раствор. Пример 8. Животным четвертой группы в количестве 8 мышей вводили внутрибрюшинно сенсибилизирующую дозу эритроцитов барана в виде 5 суспензии в физиологическом растворе в объеме 0,2 см 3. Для выявления влияния препарата на стадию взаимодействия лимфоцитов-эффекторов с сенсибилизирующим антигеном мышам четвертой опытной группы одновременно с разрешающей дозой эритроцитов барана вводили внутрибрюшинно по 0,1 см 3 раствора препарата КФ- из примера 4 (1/20 50). На 5-й день после сенсибилизации всем животным в подошвенную подушечку стопы вводили разрешающую дозу эритроцитов барана в виде 10 суспензии в физиологическом растворе в объеме 0,1 см 3. В качестве контроля всем животным в те же сроки в контралатеральную лапку в таком же объеме вводили физиологический раствор. Пример 9. Животным пятой контрольной группы в количестве 6 мышей вводили внутрибрюшинно сенсибилизирующую дозу эритроцитов барана в виде 5 суспензии в физиологическом растворе в объеме 0,2 см 3. На 5-й день после сенсибилизации всем животным в подошвенную подушечку стопы вводили разрешающую дозу эритроцитов барана в виде 10 суспензии в физиологическом растворе в объеме 0,1 см 3. В качестве контроля всем животным в те же сроки в контралатеральную лапку в таком же объеме вводили физиологический раствор. Пример 10. Через 24 часа после введения разрешающей дозы эритроцитов барана всех мышей пяти групп подвергли убою путем декапитации. Обе лапки мышей отрезали на уровне голеностопного сустава и взвешивали на весах. Определяли индекс воспаления по формуле ОК ИВ 100 К где ИВ - индекс воспаления О - вес опытной лапки К - вес контрольной лапки. В таблице 1 приведены средние значения индекса воспаления для разных групп белых мышей, которые указывают на влияние препарата КФ- на иммунную систему после однократного воздействия на разных стадиях клеточного иммунного ответа. Из данных таблицы 1 видно, что введение препарата КФодновременно с сенсибилизирующей дозой антигена(эритроцитов барана) приводило к повышению реакции гиперчувствительности замедленного типа,что выражалось в достоверном увеличении индекса воспаления. Эти данные свидетельствуют о том, что испытуемое вещество оказывает влияние на развитие первой стадии клеточного иммунного ответа, повышая накопление сенсибилизирующих лимфоцитов(тимусзависимых лимфоцитов-эффекторов). При этом обнаружена дозовая зависимость влияния препарата КФ- на процесс образования клона антиген специфических тимусзависимых лимфоцитов, причем,это влияние более выражено при введении высокой дозы, чем низкой. При введении препарата КФпосле сенсибилизации одновременно с разрешающей дозой антигена (эритроцитов барана), то есть на стадии взаимодействия лимфоцитов-эффекторов с антигеном,также наблюдалось повышение индекса воспаления в двух опытных группах по сравнению с контрольной группой животных. Таким образом, препарат КФ- оказывает стимулирующее действие при индукции реакции гиперчувствительности замедленного типа, при этом наибольшее стимулирующее действие препарат КФоказывает на стадии образования клона лимфоцитовэффекторов в концентрации 37,5 мг/кг. Пример 11. Кровь животных пяти групп,задействованных в опытах, описанных в примерах 310 и подвергшихся убою, как описано в примере 10 собирали в центрифужные пробирки,центрифугировали 10 минут при 1500 об/мин. Полученную сыворотку переносили в микропробирки и далее определяли в ней содержание цитокинов иммуноферментным методом. Во всех исследуемых группах животных этого опыта проводили исследование периферической крови с определением количества цитокинов -интерлейкина 2, интерлейкина-6, гамма-интерферона. Концентрацию цитокинов в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом. Результаты экспериментов обработаны и сравнены между исследуемыми группами статистически с использованием -критерия Стьюдента. Результаты измерения количества цитокинов в крови белых мышей приведены в таблице 2. Пример 12. Для испытания влияния КФ- на иммунитет было сформировано 3 группы беспородных белых крыс обоего пола средним весом 95 грамм. Животные, содержащиеся в одинаковых условиях,были получены одновременно из питомника. Во время всего эксперимента крысы находились на одинаковом рационе питания. Введение вещества осуществляли в одно и то же время суток (утром). Пример 13. 712,5 мг препарата растворили в 100 см 3 физиологического раствора. Получили раствор для исследования, 1 см которого содержал дозу препарата,3 равную 1/10 50 для белых крыс, а 0,5 см 3 - дозу препарата, равную 1/20 50 для белых крыс. Доза 50 для препарата была определена заранее на предварительном этапе и составила для белых крыс 750 мг на килограмм живого веса. Пример 14. Животным первой группы в количестве 12 белых крыс (6 самок и 6 самцов) ежедневно вводили внутрибрюшинно по 1 см 3 раствора препарата КФ- из примера 13 (1/10 50) в течение 10 дней. Через 24 часа после последнего введения вещества 6 крыс (3 самки и 3 самца) были подвергнуты убою путем декапитации. Кровь животных собирали в центрифужные пробирки, центрифугировали 10 минут при 1500 об/мин. Полученную сыворотку переносили в микропробирки и далее определяли в ней содержание цитокинов иммуноферментным методом. Оставшихся животных забивали на 21-е сутки после последнего введения вещества и проводили аналогичное, описанному выше, исследование крови. Результаты экспериментов обработаны и сравнены между исследуемыми группами статистически с использованием -критерия Стьюдента. Пример 15. Животным второй группы в количестве 12 белых крыс (6 самок и 6 самцов) ежедневно вводили внутрибрюшинно по 0,5 см 3 раствора препарата КФ- из примера 13 (1/20 50) в течение 10 дней. Через 24 часа после последнего введения вещества 6 крыс (3 самки и 3 самца) были подвергнуты убою путем декапитации. Кровь животных собирали в центрифужные пробирки, центрифугировали 10 минут при 1500 об/мин. Полученную сыворотку переносили в микропробирки и далее определяли в ней содержание цитокинов иммуноферментным методом. Оставшихся животных забивали на 21-е сутки после последнего введения вещества и проводили аналогичное,описанному выше, исследование крови. Результаты экспериментов обработаны и сравнены между исследуемыми группами статистически с использованием -критерия Стьюдента. Пример 16. Животным третьей контрольной группы в количестве 12 белых крыс (6 самок и 6 самцов) ежедневно вводили внутрибрюшинно по 0,5 см 3 физиологического раствора в течение 10 дней. Через 24 часа после последнего введения физиологического раствора все животные были подвергнуты убою путем декапитации. Кровь животных собирали в центрифужные пробирки, центрифугировали 10 минут при 1500 об/мин. Полученную сыворотку переносили в микропробирки и далее определяли в них содержание цитокинов и гормонов иммуноферментным методом. Результаты исследования уровня цитокинов в крови белых крыс при многократном применении препарата КФ- в различных дозах представлены в таблице 3. Как видно из таблицы 3 иммуноферментное тестирование концентраций в сыворотке крови интерлейкина-2,интерлейкина-6 и гаммаинтерферона,определяющих функциональную активность центральных иммунорегуляторных клеток,показало увеличение уровня интерлейкина-2 при ежедневном применении препарата КФ-. При этом наблюдалась дозовая зависимость повышения концентрации в сыворотке крови интерлейкина-2 после 10-кратного введения вещества крысам в дозах 75 мг/кг и 37,5 мг/кг. Через 20 дней отмечено снижение уровня в крови интерлейкина-2 до контрольных значений. Следовательно, препарат КФ оказывает иммуностимулирующее действие, что проявляется в виде индукции выработки интерлейкина-2. Таким образом, препарат КФ- оказывает иммуностимулирующее действие, что проявляется в повышении уровня интерлейкина-2 при 10-ти кратном введении вещества в дозах 1/1050 и 1/2050,повышении интерлейкина-2 и гамма интерферона при развитии реакции гиперчувствительности замедленного типа на стадии взаимодействия тимусзависимых лимфоцитов - эффекторов с антигеном. Таблица 1 Индекс воспаления после однократного воздействия КФ- на разных стадиях клеточного иммунного ответа Группы животных ИВ,Таблица 2 Концентрация цитокинов в сыворотке крови мышей после воздействия препарата КФ- в различных дозах на разных стадиях клеточного иммунитета Группы животных ИЛ-2,пг/см 3 ИФ,пг/см 3 4 Таблица 3 Влияние многократного применения препарата КФ- в различных дозах на уровень цитокинов в крови белых крыс ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения препарата КФ-,включающий культивирование гриба родав жидкой питательной среде, отличающийся тем,что, получение препарата КФ-, обладающего иммуностимулирующим действием, проводят путем культивирования штамма продуцента в питательной среде с последующим отделением мицелия, в качестве продуцента используют штамм- 166, культивируют на жидкой модифицированной среде Чапека, дополненной картофельным отваром,мицелий отделяют фильтрацией, фильтрат концентрируют в два раза под вакуумом,проводят дополнительную мембранную фильтрацию, полученный фильтрат концентрируют в пять раз, и выдерживают на холоду до отделения высокополимерных фракции в виде осадка, который отделяют повторной фильтрацией, прозрачный очищенный раствор культурального фильтрата высушивают досуха под вакуумом. 2. Применение препарата КФ- по п.1 в качестве биологически активного продукта, обладающего иммуностимулирующим действием.