Способ получения иммуноглобулиновой репликативной антирабической вакцины для активной иммунизации животных против бешенства

(51) 61 39/42 (2010.01) 61 39/205 2010.01) 61 39/395 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ иммуноглобулиновой репликативной антирабической вакцины,обладающей способностью создавать напряженный активный иммунитет против бешенства. Способ получения иммуноглобулиновой репликативной антирабической вакцины для активной иммунизации животных против бешенства, в котором нейротропный штамм фиксированного вируса бешенства СВСО-16 дважды пассируют на молодых животных путм их интрацеребрального заражения, вируссодержащим мозгом второго пассажа с адъювантами иммунизируют трех-пятикратно с интервалами в пятнадцать-двадцать дней видоидентичных взрослых животных,затем получают высокоактивную специфическую гипериммунную антирабическую сыворотку,выделяют гаммаглобулиновую фракцию, не содержащую термолабильные и термостабильные ингибиторы,которую используют в качестве гипериммунизационного антигена для иммунизации второй группы видоидентичных животных,подвергая их пяти-десятикратной иммунизации с интервалами в семь-десять дней антирабическими иммуноглобулинами, в чистом виде или с адъювантами, после чего получают от этой группы животных высокоактивную сыворотку и иммуноглобулины, антитела которых являются целевым продуктом.(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВОЙ РЕПЛИКАТИВНОЙ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ АКТИВНОЙ ИММУНИЗАЦИИ ЖИВОТНЫХ ПРОТИВ БЕШЕНСТВА(57) Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и иммунологии, а именно к вакцинам против бешенства и может быть использовано для иммунизации животных подкожно, внутрикожно, внутримышечно или внутрибрюшинно, вызывая через пять-десять дней выработку напряженного активного иммунитета,против фиксированного и уличных штаммов вируса бешенства. Технической результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении 20612 Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и иммунологии, а именно к противовирусным вакцинам и может быть использовано для активной профилактики бешенства животных. Способа получения иммуноглобулиновой репликативной антирабической вакцины для активной иммунизации против бешенства животных в нашей стране и за рубежом нет. Задачей изобретения является разработать способ получения антирабической вакцины на основе иммуноглобулиновых антител, являющихся носителями реплик активных центров антигенов фиксированного вируса бешенства, при введении которых подкожно, внутримышечно, внутрикожно животным вырабатывается активный иммунитет против бешенства. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении сыворотки и выделении из нее гамма-глобулиновой фракции,обладающей активностью антигенов вакцинного вируса бешенства вырабатывать иммунитет против бешенства при парентеральном введении. Способ получения иммуноглобулиновой репликативной антирабической вакцины для активной иммунизации животных против бешенства, в котором нейротропный штамм фиксированного вируса бешенства СВСО-16 дважды пассируют на молодых животных путм их интрацеребрального заражения, вируссодержащим мозгом второго пассажа с адъювантами иммунизируют трех-пятикратно с интервалами в пятнадцать-двадцать дней видоидентичных взрослых животных,затем получают высокоактивную специфическую гипериммунную антирабическую сыворотку,выделяют гаммаглобулиновую фракцию, не содержащую термолабильные и термостабильные ингибиторы,которую используют в качестве гипериммунизационного антигена для иммунизации второй группы видоидентичных животных,подвергая их пятидесятикратной иммунизации с интервалами в семь-десять дней антирабическими иммуноглобулинами, в чистом виде или с адъювантами, после чего получают от этой группы животных высокоактивную сыворотку и иммуноглобулины, антитела которых являются целевым продуктом. Продуцентами иммуноглобулинов являются ослы, лошади одной породы, верблюды одной породы, овцы одной породы, крупный рогатый скот одной породы, линейные кролики. Это зависит от объема конечной продукции. Выбранный вид животных, например, ослов, используют по следующей технологии проводится два интрацербральных пассажа нейротропного штамма вируса фикс бешенства на ослятах, мозг осленка второго пассажа вируса используют для приготовления гипериммунизационного антигена которым многократно иммунизируют ослов первой группы, получают от них высокоактивную специфическую антирабическую сыворотку, гаммаглобулиновая фракция которой является основой 2 гипериммунизационного антигена для проведения многократной иммунизации ослов второй группы продуцентов сыворотки и гамма-глобулина при получении конечной продукции иммуноглобулиновой репликативной антирабической вакцины. Конечный продукт иммуноглобулины репликативные являются носителями реплик антигенов вакцинного вируса фикс бешенства и при парентеральном введении вызывают развитие у животных напряженного активного иммунитета против фиксированных и уличных штаммов вируса бешенства. Степень иммуногенности контролируется на животных стандартными методами по уровню вируснейтрализирующих и переципитирующих антител, а также путем определения относительной иммуногенности. Изобретение осуществляется следующим образом. Пример 1. Штамм-16 обладает следующей характеристикой. Происхождение штамма. Штамм вируса фикс(Пастера) получен 10.10.1994 г. (ВОЗ, Женева) лабораторией ветеринарной вирусологии АЗВИ,относится в группу штаммов 1-го серотипа вирусов бешенства, серийными пассажами вируса в предельных разведениях на овцах получен нейротропный вариант вируса фикс - СВСО-16,который используется для приготовления антирабической вакцины АЗВИ, Антирабивак,гипериммунной антирабической сыворотки,высокоактивных специфических диагностикумов для реакции преципитации в агаровом геле,иммунолюминесцентной микроскопии,иммуноферментного анализа, для типизации уличных штаммов вируса бешенства в реакции нейтрализации и другими методами. Штамм характеризуется следующими признаками. Штамм нейротропен. Пассируется на теплокровных животных(плотоядные,сельскохозяйственные, лабораторные животные) путм интрацеребрального их заражения. Инкубационный период 4-7 суток, с последующим развитием у них паралитического бешенства. Титр вируса на ослах - 4,5-6,050, на овцах - 5,5-7,050, на морских свинках 6,0-7,550, на белых мышах - 6,0-7,550 в 0,1 см 3 вируссодержащей суспензии. Неконтагиозен. В естественных и природных условиях не распространяется. При подкожном,внутримышечном,внутривенном заражении, при скармливании вируса в больших объемах у животных не вызывает заболевания бешенством. Морфологические признаки. Электронномикроскопически установлено, что вирус имеет характерную для лисса вирусов пулевидную форму, размеры - 70-80 нм х 70-100 нм,с поперечной исчерченностью капсид, на поверхности которых обнаруживаются гемагглютинины в форме колбочек. При электронномикроскопическом изучении установлено,что у штамма отсутствует контаминация другими вирусами, микоплазмами. 20612 Культуральные свойства. Вирус поддерживается серийными интрацеребральными пассажами на молодых овцах. Вируссодержащая мозговая ткань сохраняется в 50-ном глицерине на фосфатном буфере рН 7,2-7,6. Контаминация бактериями,грибками, микоплазмами, другими вирусами вируссодержащей мозговой ткани не допускается и контролируется электронномикроскопически. Биохимические свойства. РНК-содержащей вирус, в состав вириона входят четыре мажорных и один минорный полипептиды. Белок,непосредственно связанный с РНК, формирует нуклеопротеид. Белок-гликопротеид. БелокРНК зависимая РНК-полимераза. Проба на диссоциацию. Фиксированный штамм СВСО-16, адаптированный к овцам серийными интрацерабральными пассажами, обладает строгой нейротропностью,вызывая у зараженных интрацеребрально различных теплокровных животных паралитическому форму бешенства со 100-ным летальным исходом. У вируса не отмечено реверсии в сторону увеличения или уменьшения инкубационного периода. В ганглиозных и пирамидальных клетках,забитых с характерной клиникой животных,обнаруживаются немногочисленные мелкие бесструктурные цитоплазматические включения,отличающиеся от характерных для уличного бешенства телец Бабеша-Негри. Вирус содержит типичный набор антигенных детерминант, характерных для вируса фикс бешенства штамма 1-го серотипа, вызывает у иммунизированных животных продукцию нейтрализующих,преципитирующих,комплементсвязывающих антител, не вызывает гемадсорбцию в культуре лейкоцитов свиней. Патогенные свойства. При определении вирулентных и патогенных свойств на различных видах лабораторных,сельскохозяйственных,плотоядных животных при подкожном,внутримышечном, внутривенном, внутрикожном,при скармливании вирус не вызывает заболевания бешенством, но при интрацеребральном введении у всех перечисленных видов животных в 100 приводит к развитию паралитического бешенства через 5-8 дней. Серологические свойства. На антигенные детерминанты вируса получены специфические высокоактивные антирабические сыворотки и соответствующие иммуноглобулины,которые применяются для диагностики бешенства методами реакции преципитации в агаровом геле, реакций нейтрализации,иммунолюминесцентной микроскопией. Штамм использовался и используется для изготовления высокоиммуногенной антирабической вакцины АЗВИ, Антирабивак, применяемые для всех видов животных в борьбе с бешенством в Казахстане и странах СНГ. Физиолого-биохимические свойства. Нейротропный вирус-фикс бешенства размножается в цитоплазме нейронов на мембранах эндоплазматического ретикулума и эргастроплазматических везикул, формируя мелкие бесструктурные цитоплазматические включения,отличающиеся морфологически от телец БабешНегри, характерных для уличных штаммов вируса бешенства. Оптимальная рН при размножении вируса в нервной ткани и сохранении его в консерванте 6,47,8. Вирус поддерживается путем интрацеребральных пассажей на животных, имея титр инфекционности в мозговой ткани 4,5-7,550 в 0,03 см 3 суспензии для белых мышей,нейтрализуется антирабическими антителами,сохраняется в 50-ном стерильном глицерине на фосфатном буферном растворе с рН 6,8-7,4 при 48 С или в лиофилизированном состоянии. Биохимические маркерные признаки. Под влиянием размножения вируса фикс в нейтронах происходят изменения метаболизма,обусловленного синтезом вирусных нуклеиновых кислот и белков, угнетение и изменение образования ферментов, повреждением ядерного хромосомного аппарата и клеточных органеля. Физиологические маркерные признаки. Выраженная нейротропность характеризуется тем,что этот вирус-фикс вызывает заболевание бешенством у животных только при интрацеребральном введении его в мозг. Вируса апатогенен при введении подкожно,внутримышечно, внутрикожно, внутрибрюшинно,при скармливании вируссодержащего мозга в больших количествах различным видам животных. Хранение в консервирующих средах. Вируссодержащую мозговую ткань стерильно в боксе разрезают на кусочки 2 см х 2 см, помещают в стерильный глицерин на фосфатном буферном растворе рН 6,8-7,4 в толстостенных колбах,стерильно закрывают пробками, хранят при температуре 4-8 С в течение 6 месяцев. Максимальная продолжительность сохранения жизнеспособности не менее одного года, при условии сохранения постоянства температурного режима. В процессе хранения может отмечаться незначительное уменьшение количества инфекционного вируса, который восстанавливается при интрацеребральном пассировании на животных. Пример 2. Для получения вакцины выбирается вид животных в зависимости от объема конечной продукции. Им могут быть ослы, лошади одной породы, верблюды одного вида, овцы одной породы или породной группы, крупный рогатый скот одной породы или породной группы, линейные кролики(при получении продукта в небольших объемах). Молодые животные 2 х-6-ти месячного возраста выбранного вида используются для проведения 2-х последовательных интрацеребральных пассажа нейротропного штамма вируса-фикс бешенства штамма СВСО-16. Вируссодержащая мозговая ткань животного второго пассажа, забитого на 6-8 день в агональном состоянии после заражения,используется для приготовления гипериммунизационного антигена,которым 3 20612 иммунизируют взрослое видоидентичное животное(осленок-осел-осел или жеребенок-лошадь-лошадь) в возрасте 8-12 месяцев с целью получения высокоактивной, специфической антирабической сыворотки. Специфичность такой сыворотки связана с тем, что на содержащие вирус фикс антигены,гомологичные виду продуцентов,животные отвечают выработкой антител против вируса фикс бешенства, не отвечая выработкой антител на собственные антигены мозговой ткани(видоидентичные) присутствующие в структуре вируса и в суспензии мозговой ткани. Пример 3. Получение специфической высокоактивной антирабической сыворотки. Для проведения гипериммунизации из вируссодержащей мозговой ткани готовится 5-10 ная суспензия, содержащая 0,6-0,8 (по сухому остатку) алюминия гидрат окиси коллоидный, 0,080,1 сапонина и 0,1-0,3 формалина. Этот антиген проверяют на стерильность в отношении бактерий,грибков стандартными методами контроля и используют для гипериммунизации видоидентичного животного в возрасте 10-12 месяцев. Схема гипериммунизации 1-ая иммунизация - антиген вводят подкожно и внутримышечно по 10 см 3 (ослу). Через 15-20 дней проводится вторая иммунизация этим же антигеном в той же дозе подкожно. 3-яя, 4-ая и 5-ая иммунизации выполняются на 12-15 дни после предыдущей антигеном без адъювантов в двойной дозе. После последней гипериммунизации на 15-18-ое сутки от гиперимунизированного животного получают сыворотку и определяют в ней преципитирующие и вируснейтрализующие антитела. 1 см 3 такой гипериммунной сыворотки должен нейтрализовать 1-10 млн. 50 в 0,03 см 3 вируса фикс для белых мышей, а в реакции преципитации с контрольным положительным мозговым антигеном, содержащим антигены вируса фикс бешенства, сыворотка должна иметь титр 116164. Пример 4. Получение гамма-глобулиновой фракции антирабической сыворотки. Полученную стерильную в отношении бактерий и грибков антирабическую сыворотку используют для выделения из нее гамма-глобулиновой фракции. Сыворотку предварительно освобождают от термолабильных и термостабильных ингибиторов,подвергают фракционированию этанолом по укороченному методу Кона (1961 г.), используя насыщение спирта 28-30. Получают фракцию гаммаглобулинов, которую собирают и отделяют от сыворотки осаждением в рефрижераторной центрифуге при - 8-12 С или методом фильтрации при этой же температуре на стерильные обеззоленные бумажные фильтры. Осадок в стерильных условиях собирается (из 1 л нативной антирабической сыворотки выход иммуноглобулинового осадка составляет 43-50 г),разводится стерильным физиологическим раствором рН 7,2-7,6 до содержания белка в растворе 101,разливается во флаконы или в ампулы (для лиофилизации),по производственной 4 необходимости к части жидкого иммуноглобулина добавляют 0,5 формалина и сохраняют при 2(8 С) до применения не менее 2-х лет. Получение антигена для гипериммунизации продуцентов конечной продукции. Продуцентов в возрасте 10-12 месяцев,принадлежащих к тому же виду, на котором готовилась гипериммунная антирабическая сыворотка, проверяют согласно требованиям,предъявляемым биопромышленностью к продуцентам антирабических, антитоксических и других гипериммунных сывороток, содержат в условиях, позволяющих их эксплуатировать длительное время. Гипериммунизационными антигенами являются антирабические иммуноглобулины, содержащие 810 белка, гомологичные виду процента (ослиный для ослов, лошадиный для лошадей), которые могут быть использованы с адъювантами 0,6-0,8 по сухому остатку алюминия гидрат окиси коллоидный 0,05-0,1 сапонина) или в нативном виде (без адъювантов). Пример 5. Схема гипериммунизации продуцентов. Сначала производят ряд инъекций 810-ных иммуноглобулинов с адъювантами(гидроксалсапонин) в возрастающих дозах, а затем одновременно вводят подкожно,внутримышечно и внутрикожно 8-10 процентный иммуноглобулин без адъювантов. Кровопускание производят через 15-18 дней после завершения гипериммунизации. Схема иммунизации в данном случае ослов следующая 1-й день 30 см 3 (8-10-ного) иммуноглобулина с адъювантами подкожно и 30 см 3 внутримышечно. 7-й день 40 см 3 иммуноглобулина с адъювантами подкожно и 40 см 3 - внутримышечно. 14-й день 50 см 3 иммуноглобулина с адъювантами подкожно и 50 см 3 - внутримышечно. 28-й день 30 см 3 иммуноглобулина с адъювантами подкожно, 30 см 3 - внутримышечно, 1 см 3 - внутрикожно. 35-й день 30 см 3 иммуноглобулина с адъювантами подкожно, 30 см 3 - внутримышечно, 1 см 3 - внутрикожно. 42-й день 30 см 3 иммуноглобулина с адъювантами подкожно, 30 см 3- внутримышечно, 1 см 3 - внутрикожно. 49-й день 30 см 3 иммуноглобулина с адъювантами подкожно, 30 см 3- внутримышечно, 1 см 3 - внутрикожно. 56-й день 40 см 3 иммуноглобулина без адъювантов - подкожно, 40 см 3- внутримышечно, 1 см 3 - внутрикожно. 70-й день кровопускание. Кровь берется из вены стерильно в объеме из расчета 0,8 л, на 100 кг массы животного. Стандартным методом получают стерильно плазму или сыворотку, которые являются конечным продуктом и проверяются на активность в реакции преципитации в агаровом геле в системе антиантитела антирабические антитела, 20612 использованные для гипериммунизации против иммуноглобулинов конечной продукции. Реакция должна быть положительной в разведениях 18-132. В случае недостаточной активности конечной продукции гипериммунизация может быть продолжена в форме 2 х -3-х дополнительных инъекций гипериммунизационного иммуноглобулина с адъювантами 40 см 3 подкожно, 40 см 3 - внутримышечно, 1 см 3 внутрикожно. Через 15-18 дней после введения последней дозы берется кровь в объеме 1,6 л на 100 кг массы животного. Получается плазма или сыворотка, из них удаляются термолабильные и термостабильные ингибиторы,выделяется гамма-глобулиновая фракция при насыщении этанолом 28-30. Сыворотка, плазма или иммуноглобулины являются конечным продуктом, из которого готовится иммуноглобулиновая репликативная антирабическая вакцина с адъювантами или без таковых в форме нативного иммуноглобулина,содержащего 5-10 белка. Продуценты конечного продукта могут быть использованы для систематического получения конечного продукта на протяжения не менее 10 лет. Их иммунизируют подкожно и внутримышечно через 2-3 дня после взятия крови ежемесячно. Пример 6. Изучение иммуногенной активности готового продукта с адъювантами проводят путем определений относительной иммуногенности. Серологическую активность определяют в реакции преципитации в агаровом геле, где в качестве антител используют гипериммунизационный иммуноглобулин, а в качестве антигена - конечный продукт иммуноглобулинновую репликативную антирабическую вакцину без адъювантов. Преципитирующая активность в РП должна быть в разведении 18 и выше. Применение иммуноглобулиновой репликативной антирабической вакцины позволит эффективно создавать у различных видов домашних и сельскохозяйственных животных напряженный активный иммунитет против бешенства. Полученная вакцина, без адъювантов может быть использована в качестве специфического активного очищенного антигена для выявления антирабических антител серологическими и иммунобиофизическими методами (РП, РСК, ИФА и др.) в сыворотках животных больных,переболевших,иммунизированных,носителей вируса бешенства в природных очагах этого особо опасного зооантропоноза. Иммуноглобулиновая репликативная антирабическая вакцина представляет собой очищенную гаммаглабулиновую фракцию сыворотки, которая не содержит вируса бешенства и его антигенов, бактерий, вирусов, токсинов,экологически чистый препарат, обладающий высокой иммуногенностью против бешенства при подкожном,внутримышечном,внутрикожном,внутрибрюшинном, и возможно, при энтеральном введении животным, сохраняет свою активность не менее пяти лет. С помощью данного способа можно получать безопасную экологически чистую иммуноглобулиновую репликативную антирабическую вакцину на основе оригинального эпизоотического штамма вируса после несколько кратного интрацеребрального пассирования его на лабораторных животных и получения нейротропного варианта. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения иммуноглобулиновой репликативной антирабической вакцины для активной иммунизации животных против бешенства,заключающийся в том,что нейротропный штамм фиксированного вируса бешенства СВСО-16 дваждыпассируют на молодых животных путм их интерцеребрального заражения, вируссодержащим мозгом зараженных животных второго пассажа с адъювантами иммунизируют трех-пятикратно с интервалами в 1520 дней видоидентичных взрослых животных, затем от них получают высокоактивную специфическую гипериммунную антирабическую сыворотку, из нее выделяют гаммаглобулиновую фракцию,не содержащую термолабильные и термостабильные ингибиторы, которую используют в качестве гипериммунизационного антигена для иммунизации второй группы видоидентичных животных,подвергая их пятидесятикратной иммунизации с интервалами в 7-10 дней антирабическими иммуноглобулинами, в чистом виде или с адъювантами после чего получают от этой группы животных высокоактивную сыворотку и иммуноглобулины, антитела которых являются целевым продуктом.