Способ получения вакцины против ящура

(51) 61 39/135 (2009.01) 61 31/12 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ языка крупного рогатого скота, вируссодержащую эпителиальную ткань гомогенизируют при добавлении культуральной жидкости в соотношении 13 или 15, полученную вируссодержащую суспензию подвергают воздействию ультразвуковых волн с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-1 при частоте 20-30 кГц, мощности 50-70 Вт/см 2 в течение 5-10 минут, экстрагируют,добавляя на 1 кг вируссодержащей эпителиальной ткани 10 л культуральной жидкости и 2 л буферного раствора, в течение 3-16 часов при температуре 24 С и перемешивании через каждые 3-4 часа, затем фильтруют, полученный фильтрат центрифугируют при 3- 4 тыс. об/мин, надосадочную жидкость сливают и смешивают с раствором 6-ного гидроксала и гликоколовым буфером, смесь перемешивают в течение 30 минут и определяют рН, после чего добавляют забуференный раствор формалина и инактивируют в течение 24 часов при температуре 25 С. Предложенный способ обеспечивает получение менее реактогенной и более высокоиммуногенной вакцины против ящура.(72) Иванов Николай Петрович Хусаинов Дамир Микдатович Шушаев Бахтыгери Хайруллович(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЯЩУРА(57) Изобретение относится к области иммунологии и может быть использовано при промышленном производстве инактивированных вакцин против ящура. Способ получения вакцины против ящура включает культивирование вируса, измельчение тканей, получение вируссодержащей суспензии,консервирование формалином,при этом культивирование вируса осуществляют на эпителии 17966 Изобретение относится к области иммунологии и может быть использовано при промышленном производстве инактивированных вакцин против ящура. Известен способ получения вакцины против ящура, путем культивирования вируса в организме крольчат с последующим измельчением их тканей и консервированием суспензии формалином.(Биологические и химиотерапевтические ветеринарные препараты. Москва, 1963, с. 95). Недостатком данного способа получения вакцины является недостаточное накопление вируса и то, что она дополнительно содержит ткани кролика, так как выращивание вируса производят в организме молодых крольчат, что придает ей высокую реактогенность. Задачей изобретения является разработка способа получения вакцины против ящура менее реактогенной и более иммуногенной вакцины. Способ получения вакцины против ящура,включает культивирование вируса, измельчение тканей, получение вируссодержащей суспензии,консервирование формалином при этом культивирование вируса осуществляют на эпителий языка крупного рогатого скота, вируссодержащую эпителиальную ткань гомогенизируют при добавлении культуральной жидкости в соотношении 13 или 15, полученную вируссодержащую суспензию подвергают воздействию ультразвуковых волн с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-1 при частоте 20-30 кГц, мощности 50-70 Вт/см 2 в течение 5-10 минут, экстрагируют,добавляя на 1 кг вируссодержащей эпителиальной ткани 10 л культуральной жидкости и 2 л буферного раствора, в течение 3-16 часов при температуре 24 С и перемешивании через каждые 3-4 часа, затем фильтруют, полученный фильтрат центрифугируют при 3- 4 тыс. об/мин, надосадочную жидкость сливают и смешивают с раствором 6-ного гидроксала и гликоколовым буфером, смесь перемешивают в течение 30 минут и определяют рН, после чего добавляют забуференный раствор формалина и инактивируют в течение 24 часов при температуре 25 С. Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Приготовления вакцины против ящура тип А. В качестве вирусного материала берут вируссодержащую эпителиальную ткань языка и культуральную жидкость,в которой культивировался известный штамм вируса типа А. Инфекционный титр вируса должен быть не ниже 10-6- 10-7 и обладать комплементсвязывающими свойствами. Вируссодержащую эпителиальную ткань предварительно измельчают на мясорубке, затем гомогенизируют при добавлении культуральной жидкости в соотношении 13 или 15. Температура не должна превышать 15 С. Затем суспензию подвергают воздействию ультразвуковых волн (с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-1 при частоте 20-30 кГц, мощности 50-70 Вт/см 2 в 2 течение 5-10 минут), экстрагируют и добавляют на 1 кг вирусной эпителиальной ткани, 10 л культуральной жидкости и 2 л буфера. Экстракцию вируса продолжают 3-16 часов при температуре 24 С, перемешивают через каждые 3-4 часа. Затем фильтруют через марлево-ватный фильтр и шелковое сито 29 и полученный фильтрат центифугируют при 3-4 тыс. об/мин. Суспензию вируса после центрифугирования используют для изготовления вакцины. Вакцину готовят по следующей прописи (из расчета на 100 л) гидроксала 6-ного 32 л,суспензии вируса 60 л, гликоколового буфера 1 л(смесь перемешивают в течение 30 минут и определяют рН) затем добавляют 1 л буферного раствора формалина и инактивируют в течение 24 часов при температуре 25 С. После инактивации добавляют глицерина 5 л и 10-ного раствора хинозола 1 л рН вакцины 8,0. Вакцину перемешивают и расфасовывают. Пример 2. Приготовления вакцины против ящура тип О. В качестве вирусного материала берут вируссодержащую эпителиальную ткань языка и культуральную жидкость,в которой культивировался известный штамм вирус типа О. Инфекционный титр вируса должен быть не ниже 10-610-7 и обладать комплементсвязывающими свойствами. Вируссодержащую эпителиальную ткань предварительно измельчают на мясорубке, затем гомогенизируют при добавлении культуральной жидкости в соотношении 13 или 15. Температура не должна превышать 15 С. Затем суспензию подвергают воздействию ультразвуковых волн (с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-1 при частоте 20-30 кГц, мощности 50-70 Вт/см 2 в течение 5-10 минут), экстрагируют и добавляют на 1 кг вирусной эпителиальной ткани, 10 л культуральной жидкости и 2 л буфера. Экстракцию вируса продолжают 316 часов при температуре 24 С, перемешивают через каждые 3-4 часа. Затем фильтруют через марлево-ватный фильтр и шелковое сито 29 и полученный фильтрат сепарируют при 3-4 тыс. об/мин. Суспензию вируса после сепарирования используют для изготовления вакцины. Вакцину готовят по следующей прописи (из расчета на 100 л) гидроксала 6-ного 32 л,суспензии вируса 60 л, гликоколового буфера 1 л(смесь перемешивают в течение 30 минут и определяют рН) затем добавляют 1 л буферного раствора формалина и инактивируют в течение 24 часов при температуре 25 С. После инактивации добавляют глицерина 5 л и 10-ного раствора хинозола 1 л рН вакцины 8,0. Вакцину перемешивают и расфасовывают. Пример 3. Приготовления вакцины против ящура тип С. В качестве вирусного материала берут вируссодержащую эпителиальную ткань языка и культуральную жидкость,в которой культивировался вирус известный штамм типа С. 17966 Инфекционный титр вируса должен быть не ниже 10-610-7 и обладать комплементсвязывающими свойствами. Вируссодержащую эпителиальную ткань предварительно измельчают на мясорубке, затем гомогенизируют при добавлении культуральной жидкости в соотношении 13 или 15. Температура не должна превышать 15 С. Затем суспензию подвергают воздействию ультразвуковых волн (с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-1 при частоте 20-30 кГц, мощности 50-70 Вт/см 2 в течение 5-10 минут), экстрагируют и добавляют на 1 кг вирусной эпителиальной ткани, 10 л культуральной жидкости и 2 л буфера. Экстракцию вируса продолжают 3-16 часов при температуре 24 С, перемешивают через каждые 3-4 часа. Затем фильтруют через марлево-ватный фильтр и шелковое сито 29 и полученный фильтрат сепарируют при 3-4 тыс. об/мин. Суспензию вируса после сепарирования используют для изготовления вакцины. Вакцину готовят по следующей прописи (из расчета на 100 л) гидроксала 6-ного 32 л,суспензии вируса 60 л, гликоколового буфера 1 л(смесь перемешивают в течение 30 минут и определяют рН) затем добавляют 1 л буферного раствора формалина и инактивируют в течение 24 часов при температуре 25 С. После инактивации добавляют глицерина 5 л и 10-ного раствора хинозола 1 л рН вакцины 8,0. Вакцину перемешивают и расфасовывают. Пример 4. Приготовления вакцины против ящура тип Азия. В качестве вирусного материала берут вируссодержащую эпителиальную ткань языка и культуральную жидкость,в которой культивировался вирус известного штамма тип Азия. Инфекционный титр вируса должен быть не ниже 10-610-7 и обладать комплементсвязывающими свойствами. Вируссодержащую эпителиальную ткань предварительно измельчают на мясорубке, затем гомогенизируют при добавлении культуральной жидкости в соотношении 13 или 15. Температура не должна превышать 15 С. Затем суспензию подвергают воздействию ультразвуковых волн (с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-1 при частоте 20-30 кГц, мощности 50-70 Вт/см 2 в течение 5-10 минут), экстрагируют и добавляют на 1 кг вирусной эпителиальной ткани, 10 л культуральной жидкости и 2 л буфера. Экстракцию вируса продолжают 3-16 часов при температуре 24 С, перемешивают через каждые 3-4 часа. Затем фильтруют через марлево-ватный фильтр и шелковое сито 29 и полученный фильтрат сепарируют при 3-4 тыс. об/мин. Суспензию вируса после сепарирования используют для изготовления вакцины. Вакцину готовят по следующей прописи (из расчета на 100 л) гидроксала 6-ного 32 л,суспензии вируса 60 л, гликоколового буфера 1 л раствора формалина и инактивируют в течение 24 часов при температуре 25 С. После инактивации добавляют глицерина 5 л и 10-ного раствора хинозола 1 л рН вакцины 8,0. Вакцину перемешивают и расфасовывают. Пример 5. Приготовления бивалентной вакцины против ящура типы (1 - А и О, 2 - А и С, 3 - А и Азия, 4 - А и Азия, 5 - О и Азия, 6 - С и Азия, 7 - С и А). В качестве вирусного материала берут вируссодержащую эпителиальную ткань языка и культуральную жидкость,в которой культивировились вирусы двух типов (1 А и О, 2 А и С, 3-А и Азия, 4 -А и Азия, 5 - О и Азия, 6 - С и Азия, 7 - С и А) известных штаммов. Инфекционный титр вируса должен быть не ниже 10-610-7 и обладать комплементсвязывающими свойствами. Вируссодержащую эпителиальную ткань предварительно измельчают на мясорубке, затем гомогенизируют при добавлении культуральной жидкости в соотношении 13 или 15. Температура не должна превышать 15 С. Затем суспензию подвергают воздействию ультразвуковых волн (с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-1 при частоте 20-30 кГц, мощности 50-70 Вт/см 2 в течение 5-10 минут), экстрагируют и добавляют на 1 кг вирусной эпителиальной ткани, 10 л культуральной жидкости и 2 л буфера. Экстракцию вируса продолжают 3-16 часов при температуре 24 С, перемешивают через каждые 3-4 часа. Затем фильтруют через марлево-ватный фильтр и шелковое сито 29 и полученный фильтрат сепарируют при 3-4 тыс. об/мин. Суспензию вируса после сепарирования используют для изготовления вакцины. Вакцину готовят по следующей прописи (из расчета на 100 л) гидроксала 6-ного 32 л,суспензии вируса 60 л, гликоколового буфера 1 л(смесь перемешивают в течение 30 минут и определяют рН) затем добавляют 1 л буферного раствора формалина и инактивируют в течение 24 часов при температуре 25 С. После инактивации добавляют глицерина 5 л и 10-ного раствора хинозола 1 л рН вакцины 8,0. Вакцину перемешивают и расфасовывают. Пример 6. Приготовления моновалентной вакцины против ящура (типы 1 - А, С, Азия и О, 2 - А, Азия и С,3 - А, О и Азия, 4 - С, О и Азия, 5 - О, А и С). В качестве вирусного материала берут вируссодержащую эпителиальную ткань языка и культуральную жидкость,в которой культивировились вирусы двух типов (1 - А, С, Азия и О, 2 - А, Азия и С, 3 - А, О и Азия, 4 - С, О и Азия,5 - О, А и С) известных штаммов. Инфекционный титр вируса должен быть не ниже 10-610-7 и обладать комплементсвязывающими свойствами. Вируссодержащую эпителиальную ткань предварительно измельчают на мясорубке, затем гомогенизируют при добавлении культуральной жидкости в соотношении 13 или 15. Температура не должна превышать 15 С. Затем суспензию подвергают воздействию ультразвуковых волн (с 3 17966 помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-1 при частоте 20-30 кГц, мощности 50-70 Вт/см 2 в течение 5-10 минут), экстрагируют и добавляют на 1 кг вирусной эпителиальной ткани 10 л культуральной жидкости и 2 л буфера. Экстракцию вируса продолжают 3-16 часов при температуре 24 С, перемешивают через каждые 3-4 часа. Затем фильтруют через марлево-ватный фильтр и шелковое сито 29 и полученный фильтрат сепарируют при 3-4 тыс. об/мин. Суспензию вируса после сепарирования используют для изготовления вакцины. Вакцину готовят по следующей прописи (из расчета на 100 л) гидроксала 6-ного 32 л,суспензии вируса 60 л, гликоколового буфера 1 л(смесь перемешивают в течение 30 минут и определяют рН) затем добавляют 1 л буферного раствора формалина и инактивируют в течение 24 часов при температуре 25 С. После инактивации добавляют глицерина 5 л и 10-ного раствора хинозола 1 л рН вакцины 8,0. Вакцину перемешивают и расфасовывают. Контроль вакцины. По истечении 10 дней с момента изготовления каждую серию вакцины проверяют на стерильность,безвредность,авирулентность и активность. На стерильность вакцину проверяют путем высева на обычные питательные среды мясопептонный бульон (во флаконы до 100 ил), на мясопептонный бульон под вазелиновым маслом (во флаконы по 100 мл) и на мясопентонный агар (в пробирках). Флаконы с мясопептонным бульоном под вазелиновым маслом перед высевом в них вакцины кипятят в водяной бане в течение 20-30 минут для уничтожения посторонней микрофлоры. Высевы из вакцины на аэробные среды выдерживают в термостате при температуре 37 в течение 7 суток, а на анаэробные среды - в течение 15 суток с однократным пересевом во флаконы с этой же средой через 5 суток. Вакцина должна быть стерильной допускается к выпуску вакцина, содержащая непатогенную микрофлору. Для проверки на безвредность вакцину вводят под кожу трем морским свинкам в дозе по 3 мл,трем белым мышам в дозе по 0,5 мл и двум кроликам по 5 мл каждому. Срок наблюдения за животными - 10 суток. В случае падежа подопытных животных выпуск серии вакцины задерживают до определения причины их гибели. На авирулентность вакцину проверяют на молодняке крупного рогатого скота в возрасте 1-2 лет не ниже средней упитанности и неиммунного к ящуру. Для этого трем животным подкожно вводят вакцину по 20 мл каждому и одновременно в подслизистую оболочку языка по 3-5 мл. Срок наблюдения за животными - 8 суток. Вакцина считается авирулентнюй, если все привитые животные останутся клинически здоровыми. 4 На активность вакцину проверяют на восьми головах молодняка крупного рогатого скота в возрасте 1-2 лет, неиммунного к ящуру, из них трех животных прививают вакциной в дозе по 5 мл,трех - в дозе по 10 мл и двух оставляют непривитыми (для контроля). Спустя 15 суток после введения вакцины привитых и контрольных животных искусственно заражают суспензией вируса ящура (1500) путем втирания зубной щеткой в слизистую оболочку языка. Для контрольного заражения берут исходные штаммы афтозного вируса ящура от крупного рогатого скота в разведении 1500 на физиологическом или фосфатном буферном растворе (рН 7,6). Вакцина считается активной, если вакцинированные животные останутся здоровыми после контрольного заражения, а контрольные заболеют ящуром с генерализацией процесса. Вакцина считается также активной и пригодной к практическому применению, если 50 привитых животных заболевают в легкой форме (первичный процесс), а контрольные - с генерализацией процесса. Срок наблюдения за титражными животными 10 суток с момента их заражения. Для проверки бивалентной вакцины на активность берут удвоенное число животных, из которых шесть привитых и два контрольных заражают вирусом типа О, а шесть других принятых в два контрольных заражают вирусом типа А. На активность вакцину проверяют на молодняке крупного рогатого скота в возрасте -2 лет. Для этого четырем животным подкожно вводят до 10 мл вакцины. Контрольное заражение четырех вакцинированных и двух контрольных,невакцинированных животных производят суспензией афтозного вируса ящура в разведении 1500 через 15-20 дней после введения вакцины. Срок наблюдения - 10 суток. Вакцина считается активной,если вакцинированные животные не заболевают ящуром после контрольного заражения или заболевают с первичными афтами,а контрольные,невакцинированные, животные заболевают с генерализацией процесса. Срок годности гидроокисьалюминиевой противоящурной вакцины, изготовленной из вируса,культивируемого на эпителии языков крупного рогатого скота - 6 месяцев со дня изготовления, при условии хранения в темном сухом и прохладном месте при температуре от 1 до 10 С. Вакцина, подвергавшаяся замораживанию, для применения непригодна. Перед применением флаконы с вакциной необходимо тщательно встряхивать. Хранение вакцины при температуре выше 10 С особенно продолжительное время значительно снижает ее активность. Применение вакцин. Дозы вакцин животным крупному рогатому скоту, овцам и козам старше трех месяцев - 5 мл телятам, ягнятам и козлятам в 17966 возрасте от двух до трех месяцев - 3 мл свиньям старше четырех месяцев - 10 мл поросятам в возрасте от трех до четырех месяцев - 5 мл. Эффективность предлагаемых вакцин изучали на поголовье крупного рогатого скота различного возраста. При применении их не отмечалось каких-либо осложнений у взрослых животных и молодняка прибивного возраста. Применяли вакцину с профилактической целью всем видам восприимчивых к ящуру животных,начиная с 2-месячного возраста. Телят, ягнят и поросят до 2-месячного возраста вакцинами не прививают, так как животные в таком возрасте неспособны вырабатывать вакцинальный иммунитет. У привитых животных на месте введения вакцины не отмечалось какой-либо реакции, тогда как у привитых лапинизированной вакциной через 10- 20 часов после прививки появлялась местная реакция в виде небольшой, плотной, болезненной припухлости размером 3-6 см или 5-10 см, которая начинает рассасываться с 5-8-го дня после вакцинация. У значительного процента вакцинированных животных припухлость размером в грецкий орех остается нерассосавшейся. Общая реакция организма может проявляться в виде кратковременного (в течение суток) повышения температуры на 1-1,5. Иммунитет у вакцинированных животных наступает через 2 недели после введения вакцины и остается достаточно напряженным в течение 6 месяцев, тогда как при применении лапинизированной вакцины - 34 месяцев. У молодняка крупного рогатого скота в возрасте от 1 года до РА лет поствакцинальный иммунитет наступает в те же сроки и продолжительности, что и у взрослых животных (12-15 дней), однако при применении лапинизированной вакцины продолжительность его несколько короче, и в случае угрозы заражения их следует ревакцинировать через 2-2,5 месяца после первой вакцинации. При применении лапинизированной вакцины у молодняка в возрасте 9-12 месяцев поствакцинальный иммунитет еще короче, а у телят в возрасте 3-4 месяцев после введения вакцины отмечается слабое и медленное появление антител. Титр их начинает быстро снижаться, и через 2 месяца около 60 животных, как правило, не имеют выраженного иммунитета. Поэтому,при применении лапинизированной вакцины требуется ревакцинация молодняка,сопровождающая быстрым ростом титра антител, который, однако, не является столь стойким как при применении предлагаемой вакцины и быстро снижается. Предложенный способ обеспечивает получение вакцины против ящура менее реактогенной и более высокоиммуногенной. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения вакцины против ящура,включающий культивирование вируса, измельчение тканей, получение вируссодержащей суспензии,консервирование формалином, отличающийся тем,что культивирование вируса осуществляют на эпителии языка крупного рогатого скота,вируссодержащего эпителиальную ткань гомогенизируют при добавлении культуральной жидкости в соотношении 13 или 15, полученную вируссодержащую суспензию подвергают воздействию ультразвуковых волн с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-1 при частоте 20-30 кГц, мощности 50-70 Вт/см 2 в течение 5-10 минут,экстрагируют,добавляя на 1 кг вируссодержащей эпителиальной ткани 10 л культуральной жидкости и 2 л буферного раствора,в течение 3-16 часов при температуре 2-4 С и перемешивании через каждые 3-4 часа, затем фильтруют, полученный фильтрат центрифугируют при 3-4 тыс. об/мин, надосадочную жидкость сливают и смешивают с раствором 6 -ного гидроксала и гликоколовым буфером, смесь перемешивают в течение 30 минут и определяют рН, после чего добавляют забуференный раствор формалина и инактивируют в течение 24 часов при температуре 25 С.