Способ диагностики токсоплазмоза у собак

(51) 01 33/53 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ готовят тонкие мазки из сенсибилизированных антигеном эритроцитов, мазки высушивают на воздухе и фиксируют охлажденным ацетоном (-58 С) в течении 10 секунд, каждый мазок делят восковым карандашом на 6-8 зон, в которые наносят по 1-2 капли в разные зоны из сывороток собак(испытуемые и контрольные) в разведении 12 и 15,далее, мазки с сыворотками инкубируют во влажной камере 30-40 минут при 37-38 С, затем промывают их забуференным физиологическим раствором,мазки высушивают на воздухе и наносят по 1-2 капли антивидовой к иммуноглобулину собак меченной сыворотки в рабочем разведении, снова их помещают в термостат для инкубирования, по истечении 30-40 минут мазки промывают забуференным физиологическим раствором,высушивают и просматривают под люминисцентным микроскопом под иммерсией. Способ диагностики токсоплазмоза собак имеет следующие преимущества сокращаются затраты на производство дигностикума,повышается достоверность исследования.(72) Сабаншиев Мажит Толымбеков Канагат Хусаинов Дамир Микдатович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Казахский национальный аграрный университет Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТОКСОПЛАЗМОЗА У СОБАК(57) Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для лабораторной серологической диагностики токсоплазмоза у собак. Способ диагностики токсоплазмоза у собак,включающий исследование сыворотки крови этих животных, при этом в качестве антигена используют стабилизированный эритроцитарный диагностикум сенсибилизированный токсоплазменным антигеном,для постановки реакции на предметном стекле Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для лабораторной серологической диагностики токсоплазмоза у собак. Известен способ диагностики токсоплазмоза у собак, включающий исследование сыворотки крови этих животных путем постановки реакции связывания комплемента (РСК). В основе реакции лежит способность комплемента специфически связываться с комплексами антигенантитело. Для выявления этой связи в виде лизиса эритроцитов требуется внесение в определенной последовательности дополнительных компонентов(инактивированной гемолитической сыворотки и эритроцитов барана). В реакции участвуют структурный белок микробной клетки в качестве антигена,сыворотка крови животного с возможными антителами, комплемент, эритроциты барана, гемолитическая сыворотка Наставление по применению набора для диагностики токсоплазмоза в РСК. Утверждено Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия 04.12.97 (13-7-2/1107). Недостатком этой реакции по сравнению с заявленной является многокомпонентность, высокая трудоемкость и долговременность(процесс связывания комплемента должен проводится в течение 16-18 часов), низкая чувствительность и специфичность. Известен, принятый за прототип, способ диагностики токсоплазмоза у собак, включающий исследование сыворотки крови этих животных путем постановки реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ). Предлагаемая РНИФ выполняется при наличии корпускулярного антигена токсоплазм, нанесенных промышленным путем в лунки предметных стекол, сыворотки исследуемых собаке и антител к иммуноглобулину собаки, меченных флюорохромом. При этом обеспечивается снижение числа компонентов реакции, ее трудоемкости и упрощение выполнения исследований и уменьшение затрат времени на получение результата диагностических исследований Патент РФ 2287154. Способ диагностики токсоплазмоза у собак и кошек. Класс МПК 7 01031/00. (2006.11.10). Недостатком этой реакции по сравнению с заявленной является высокая стоимость и низкая чувствительность и специфичность. Задачей, на решение которой направлено изобретение, является снижение стоимости и повышение чувствительности диагностики на всех стадиях заболевания токсоплазмозом, обеспечение надежности выявления инфекции на ранних стадиях при малом содержании антител в исследуемой сыворотке больного животного. Технический результат изобретения заключается в снижении стоимости диагностики, в повышении чувствительности и специфичности реакции. Сущность изобретения сводится к следующему. Предлагаемая РНИФ выполняется при наличии в качестве антигена стабилизированного эритроцитарного диагностикума,сенсибилизированного токсоплазменным 2 антигеном, сыворотки исследуемых собак и антител к иммуноглобулинам собаки,меченных флюорохромом. Отличия от прототипа в реакции участвуют более не корпускулярный антиген токсоплазм, а более специфичный компонент стабилизированный эритроцитарный диагностикум,сенсибилизированный токсоплазменным растворимым антигеном, а результат реакции учитывается с использованием люминесцентного микроскопа, не по наличию светящихся токсоплазм,а по наличию светящихся по периферии эритроцитов. Реакция может быть выполнена следующим образом. Реакцию ставят на обезжиренном предметном стекле. Для реакции необходимы следующие компоненты формалинизированные эритроциты барана, сенсибилизированные токсоплазменным антигеном, исследуемые сыворотки крови собак,положительные и отрицательные контрольные сыворотки собак, физиологический забуференный раствор, антивидовая к иммуноглобулину собак люминисцирующая сыворотка и люминисцентный микроскоп. Для постановки реакции на предметном стекле готовят тонкие мазки из сенсибилизированных токсоплазменным антигеном эритроцитов. Мазки высушивают на воздухе и фиксируют охлажденным ацетоном (-5-8 С) в течении 10 секунд. Каждый мазок делят восковым карандашом на 6-8 зон, в которые наносят по 1-2 капли в разные зоны из сывороток (испытуемые и контрольные) в разведении 12 и 15. Далее, мазки с сыворотками инкубируют во влажной камере 30-40 минут при 3738 С, затем промывают их забуференным физиологическим раствором. Мазки высушивают на воздухе и наносят по 1-2 капли антивидовой к иммунглобулину собак меченной сыворотки в рабочем разведении и снова их помещают в термостат для инкубирования. По истечении 30-40 минут мазки снова промывают забуференным физиологическим раствором, высушивают и просматривают под люминисцентным микроскопом под иммерсией. Обычно наблюдают следующую картину при отрицательном результате эритроциты светятся тусклым сероватым цветом, или светящихся эритроцитов нет. В препаратах, с положительной реакцией,наблюдается желто-зеленое периферическое свечение эритроцитов. Интенсивность свечения оценивают в крестах 4 - яркая, светящаяся желто-зеленая периферическая люминесценция эритроцитов 3 - отчетливо выраженная достаточно яркая желто-зеленая периферическая люминесценция эритроцитов 2 - неяркая периферическая люминесценция эритроцитов желтого цвета 1 - слабая периферическая люминесценция эритроцитов желто-серого цвета Контролем служит заведомо отрицательная и положительная противотоксоплазменная сыворотка собак. Для изготовления сенсибилизированных эритроцитов барана используется дезинтеграт токсоплазм. Отмытые токсоплазмы в количестве 10 см 3 ресуспендируются в 200 см 3 дистиллированной воды и подвергаются обработке ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут. Затем ультразвуковой лизат центрифугируется при 8-10 тыс. оборотов 5-10 минут, надосадочная жидкость собирается, а осадок ресуспендируется в 200 мл дистиллированной воды, и повторно подвергается обработке ультразвуком до получения гомогенной суспензии (при 15-20 КГц в течение 2530 минут). Далее ультразвуковой лизат центрифугируется при 8-10 тыс. оборотов 510 минут, надосадочная жидкость собирается, а осадок суспендируется в 200 мл дистиллированной воды, и третий раз подвергается обработке ультразвуком до получения гомогенной суспензии(при 15-20 КГц в течение 25-30 минут), с последующим сбором надосадочной жидкости. Такая процедура повторяется четвертый и пятый раз. Собранную надосадочную жидкость объединяют. Полученный лизат (сенситан) используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов. Предварительно до сенсибилизации формалинизированные эритроциты обрабатываются детергентом - додецилсульфатом натрия в 1-ной концентрации при температуре 50-60 С в течение 30 мин. Сенсибилизация формалинизированных эритроцитов после обработки додецилсульфатом натрия проводится оптимальной дозой сенситина,которая определяется путем титрации его с использованием стандартного образца противотоксоплазменной сыворотки. Специфичность и активность готового эритроцитарного антигена проверяются путем исследования в РНИФ с отрицательной сывороткой и стандартного образца противотоксоплазменной сыворотки. Пример определения оптимальных условий обработки формалинизированных эритроцитов додецилсульфатом натрия и сенсибилизации их сенситином (липополисахаридобелковый комплекс). Определение оптимальной концентрации додецилсульфата натрия, требуемой для повышения адсорбционных свойств эритроцитов и получения специфичного и активного эритроцитарного антигена для РНИФ, проводится путем обработки 10 взвеси формалинизированных эритроцитов разными концентрациями(1,0 1,5,) додецилсульфата натрия и проверки активности и специфичности в РНИФ антигена, полученного путем сенсибилизации эритроцитов, обработанных разными концентрациями указанного детергента. Оптимальную сенсибилизирующую дозу сенситина,необходимую для получения стандартного антигена для РНИФ с оптимальной активностью, определяют путем сенсибилизации(предварительно обработанных додецилсульфатом натрия) возрастающими дозами сенситина и проверки серологической активности сенсибилизированных эритроцитов (антигена) в РНГА с использованием стандартного образца противотоксоплазменной сыворотки. Для сенсибилизации эритроцитов к 1 см 3 5-ной их взвеси добавляют по 0,5 1,0 1,5 2,0 см 3 сенситина. Антиген, изготовленный путем сенсибилизации эритроцитов, не обработанных додецилсульфатом натрия, обладает низкой активностью. Обработка эритроцитов додецилсульфатом натрия повышает активность эритроцитарного антигена. Наиболее оптимальной для обработки эритроцитов является 1-ная концентрация додецилсульфата натрия,позволяющая получить эритроцитарный антиген,обладающий достаточно высокой активностью и не дающий неспецифические реакции с негативной сывороткой и физраствором. Наименьшей дозой сенситина, позволяющей получить антиген с достаточно высокой активностью, является 1,01,5 см 3 его на 1 см 3 5-ной взвеси формалинизированных эритроцитов,предварительно обработанных детергентом. Следовательно, обработка эритроцитов 1,0-ной концентрацией додецилсульфата натрия и сенсибилизация их, из расчета 1-1,5 см 3 сенситина на 1 мл 5-ной взвеси эритроцитов, позволяет получить специфичный и активный эхинококкозный эритроцитарный антиген для реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ). Способ диагностики токсоплазмоза собак имеет следующие преимущества сокращаются затраты на производство дигностикума,повышается достоверность исследования. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики токсоплазмоза у собак,включающий исследование сыворотки крови,отличающийся тем, что в качестве антигена используют стабилизированный эритроцитарный диагностикум сенсибилизированный токсоплазменным антигеном, для постановки реакции на предметном стекле готовят тонкие мазки из сенсибилизированных антигеном эритроцитов,мазки высушивают на воздухе и фиксируют охлажденным ацетоном (-5-8 С) в течении 10 секунд, каждый мазок делят восковым карандашом на 6-8 зон, в которые наносят по 1-2 капли в разные зоны из сывороток собак(испытуемые и контрольные) в разведении 12 и 15,далее, мазки с сыворотками инкубируют во влажной камере 30-40 минут при 37-38 С, затем промывают их забуференным физиологическим раствором,мазки высушивают на воздухе и наносят по 1-2 капли антивидовой к иммуноглобулину собак меченной сыворотки в рабочем разведении, снова их помещают в термостат для инкубирования, по истечении 30-40 минут мазки промывают забуференным физиологическим раствором, 3 люминисцентным микроскопом под иммерсией.