Способ диагностики анаплазмоза у крупного рогатого скота

(51) 01 31/00 (2006.01) 61 10/00 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ непрямой иммунофлуоресценции, в качестве антигена используют стабилизированный эритроцитарный диагностикум сенсибилизированный анаплазменным антигеном,для постановки реакции на предметном стекле готовят тонкие мазки из сенсибилизированных антигеном эритроцитов, мазки высушивают на воздухе и фиксируют охлажденным ацетоном (-58 С) в течении 10 секунд, каждый мазок делят восковым карандашом на 6-8 зон, в которые наносят по 1-2 капли в разные зоны из сывороток крупного рогатого скота (испытуемые и контрольные) в разведении 12 и 15, далее, мазки с сыворотками инкубируют во влажной камере 30-40 минут при 3738 С, затем промывают их забуференным физиологическим раствором, мазки высушивают на воздухе и наносят по 1-2 капли антивидовой к иммуноглобулину крупного рогатого скота меченной сыворотки в рабочем разведении, затем помещают их в термостат для инкубирования, по истечении 30-40 минут мазки промывают забуференным физиологическим раствором,высушивают и просматривают под люминисцентным микроскопом под иммерсией. Способ диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота имеет следующие преимущества сокращаются затраты на производство диагностикума,повышается достоверность исследования.(72) Шабдарбаева Гульнар Сабыровна Балгимбаева Айжан Ильясовна Хусаинов Дамир Микдатович Турганбаева Гульнар Елдесбаевна Ахметова Гульнази Даулетхановна Абеуов Хайрулла Блялович Нразы Бану мртайызы Баймурзаева Маржан Саруаркызы Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Ибажанова Асем Сериковна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Казахский национальный аграрный университет Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Георгиу Х. Диагностическая ценность ИФА и РНГА при анаплазмозе // Тезисы докладов и сообщений четвертого съезда Всесоюзного общества протозоологов Современные проблемы протозоологии. Л., 1987, с.125-126(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АНАПЛАЗМОЗА У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(57) Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для лабораторной серологической диагностики анаплазмоза у крупного рогатого скота. Способ диагностики анаплазмоза у крупного рогатого скота,включающий исследование сыворотки крови этих животных, при этом исследование осуществляют постановкой реакции Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для лабораторной серологической диагностики анаплазмоза у крупного рогатого скота. Известен способ диагностики анаплазмоза у крупного рогатого скота,включающий исследование сыворотки крови этих животных путем постановки реакции связывания комплемента(РСК). В основе реакции лежит способность комплемента специфически связываться с комплексами антигенантитело. Для выявления этой связи в виде лизиса эритроцитов требуется внесение в определенной последовательности дополнительных компонентов (инактивированной гемолитической сыворотки и эритроцитов барана). В реакции участвуют структурный белок микробной клетки в качестве антигена, сыворотка крови животного с возможными антителами,комплемент, эритроциты барана, гемолитическая сыворотка Степанова Н.И. РСК при анаплазмозе крупного рогатого скота //Ветеринария. - М., 1961,4. - с.22-25 Недостатком этой реакции по сравнению с заявленной,является многокомпонентность,высокая трудоемкость и долговременность (процесс связывания комплемента должен проводится в течение 16-18 часов), низкая чувствительность и специфичность. Известен, принятый за прототип, способ диагностики анаплазмоза,включающий исследование сыворотки крови этих животных путем постановки реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). В основе реакции лежит способность эритроцитов адсорбировать на поверхности анаплазменный антиген. После соответствующей обработки таких эритрцитов,получают анаплазменный эритроцитарный диагностикум. При добавлении в соответствующих условиях сыворотки больных анаплазмозом крупного рогатого скота происходит их агглютинация(склеивание),что является диагностической оценкой реакции. Георгиу . Диагностическая ценность ИФА и РНГА при анаплазмозе //Тезисы докладов и сообщений четвертого съезда Всесоюзного общества протозоологов Современные проблемы протозоологии. - Л., 1987. - с.125-126 Недостатком способа является недостаточная чувствительность реакции. Задача изобретения - разработка и внедрение в ветеринарную практику более эффективного способа диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота. Техническая сущность изобретения состоит в разработке более эффективного способа диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота. Это достигается тем,что диагностику осуществляют постановкой реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ), при этом в качестве антигена используют стабилизированный эритроцитарный диагностикум,сенсибилизированный анаплазменным антигеном, а в качестве индикаторной системы антивидовую к иммуноглобулину крупного рогатого скота меченную флуорохромом сыворотку. Пример осуществления этого способа. Реакцию ставят на обезжиренном предметном стекле. Для реакции необходимы следующие компоненты формалинизированные эритроциты барана,сенсибилизированные анаплазменным антигеном исследуемые сыворотки крови крупного рогатого скота положительные и отрицательные контрольные сыворотки крупного рогатого скота физиологический забуференный раствор,антивидовая к иммуноглобулину крупного рогатого скота люминисцирующая сыворотка и люминисцентный микроскоп. Для постановки реакции на предметном стекле готовят тонкие мазки из сенсибилизированных анаплазменным антигеном эритроцитов. Мазки высушивают на воздухе и фиксируют охлажденным ацетоном (-5-8 С) в течении 10 секунд. Каждый мазок делят восковым карандашом на 6-8 зон, в которые наносят по 1-2 капли в разные зоны из сывороток (испытуемые и контрольные) в разведении 12 и 15. Далее, мазки с сыворотками инкубируют во влажной камере 30-40 минут при 3738 С, затем промывают их забуференным физиологическим раствором. Мазки высушивают на воздухе и наносят по 1-2 капли антивидовой к иммуноглобулину крупного рогатого скота меченной сыворотки в рабочем разведении и снова их помещают в термостат для инкубирования. По истечении 30-40 минут мазки снова промывают забуференным физиологическим раствором,высушивают и просматривают под люминисцентным микроскопом под иммерсией. Обычно наблюдают следующую картину при отрицательном результате эритроциты светятся тусклым сероватым цветом, или светящихся эритроцитов нет. В препаратах, с положительной реакцией,наблюдается желто-зеленое периферическое свечение эритроцитов. Интенсивность свечения оценивают в крестах 4 - яркая, светящаяся желто-зеленая периферическая люминесценция эритроцитов 3 - отчетливо выраженная достаточно яркая желто-зеленая периферическая люминесценция эритроцитов 2 - неяркая периферическая люминесценция эритроцитов желтого цвета 1 - слабая периферическая люминесценция эритроцитов желто-серого цвета- - отсутствие специфической люминесценции. Контролем служит заведомо отрицательная и положительная противоанапламенная сыворотка крупного рогатого скота. Для изготовления сенсибилизированных эритроцитов барана используется дезинтеграт анаплазм). Отмытые анаплазмы в количестве 10 см 3 ресуспендируются в 200 см 3 дистиллированной воды и подвергаются обработке ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут. Затем ультразвуковой лизат центрифугируется при 8-10 тыс. оборотов 5-10 минут, надосадочная жидкость собирается, а осадок ресуспендируется в 200 см 3 дистиллированной воды, и повторно подвергается обработке ультразвуком до получения гомогенной суспензии(при 15-20 КГц в течение 25-30 минут). Далее ультразвуковой лизат центрифугируется при 8-10 тыс. оборотов 5-10 минут, надосадочная жидкость собирается, а осадок суспендируется в 200 мл дистиллированной воды, и третий раз подвергается обработке ультразвуком до получения гомогенной суспензии (при 15-20 КГц в течение 25-30 минут), с последующим сбором надосадочной жидкости. Такая процедура повторяется четвертый и пятый раз. Собранную надосадочную жидкость объединяют. Полученный лизат (сенситан) используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов. Предварительно до сенсибилизации формалинизированные эритроциты обрабатываются детергентом - додецилсульфатом натрия в 1-ной концентрации при температуре 50-60 С в течение 30 мин. Специфичность и активность готового эритроцитарного антигена проверяются путем исследования в РНИФ с отрицательной сывороткой и стандартного образца противоанаплазменной сыворотки. Способ диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота имеет следующие преимущества сокращается трудоемкость диагностики анаплазмоза,повышается достоверность исследования. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики анаплазмоза у крупного рогатого скота,включающий исследование сыворотки крови, отличающийся тем, что исследование осуществляют постановкой реакции непрямой иммунофлуоресценции с использованием в качестве антигена стабилизированного эритроцитарного диагностикума сенсибилизированного анаплазменным антигеном,для постановки реакции на предметном стекле готовят тонкие мазки из сенсибилизированных антигеном эритроцитов, мазки высушивают на воздухе и фиксируют охлажденным ацетоном (-58 С) в течении 10 секунд, каждый мазок делят восковым карандашом на 6-8 зон, в которые наносят по 1-2 капли в разные зоны из сывороток крупного рогатого скота (испытуемые и контрольные) в разведении 12 и 15, далее, мазки с сыворотками инкубируют во влажной камере 30-40 минут при 3738 С, затем промывают их забуференным физиологическим раствором, мазки высушивают на воздухе и наносят по 1-2 капли антивидовой к иммуноглобулину крупного рогатого скота меченной сыворотки в рабочем разведении, затем помещают их в термостат для инкубирования, по истечении 30-40 минут мазки промывают забуференным физиологическим раствором,высушивают и просматривают под люминисцентным микроскопом под иммерсией.