Способ диагностики карантинного заболевания – бактериального ожога на плодовых культурах

(51) 01 1/00 (2006.01) 01 63/00 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ выявления очагов карантинного заболевания плодовых культур бактериального ожога. Задачей изобретения является разработать способ быстрой и упрощенной диагностики,карантинного заболевания плодовых культур бактериального ожога,приемлемы в производственных условиях для своевременного выявления очагов заболевания и проведения карантинных мероприятий. Предлагаемое изобретение позволяет провести диагностику карантинного заболевания бактериального ожога плодовых культур без изолирования возбудителя в чистую культуру по выделению грязно-белого экссудата при инокулировании тест объекта незрелых плодов груши по методу Уайта. Это позволит быстро выявить очаги данного заболевания и провести своевременные карантинные мероприятия и предотвратить дальнейшее распространение болезни. Способ может быть использован и в карантине растений районными и областными службами фитосанитарии и карантина для быстрого выявления очагов бактериального ожога и своевременного проведения карантинных мероприятий.(72) Джаймурзина Алия Абдрахимовна Сагитов Абай Оразулы Умиралиева Жансая Зиятхановна Копжасаров Бакыт Кенжекожаевич(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский институт защиты и карантина растений(56) Джаймурзина А.А., Исин М.М., Умиралиева Ж.З. Изоляция и идентификация возбудителя бактериального ожога плодовых культур на юге и юге-востоке Казахстана. Защита растений и экологическая устойчивость агробиоценозов. Материалы Международной научной конференции. Алматы, 2014. С.389-397(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ КАРАНТИННОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ОЖОГА НА ПЛОДОВЫХ КУЛЬТУРАХ(57) Изобретение относится к области сельскохозяйственного производства, а именно к защите растений, и может быть использовано в карантине растений районными и областными службами фитосанитарии и карантина для Изобретение относится к области сельскохозяйственного производства, а именно к защите растений и может быть использовано в карантине растений районными и областными службами фитосанитарии и карантина для выявления очагов карантинного заболевания плодовых культур бактериального ожога. Известен способ визуальной диагностики карантинного заболевания плодовых культур бактериального ожога по симптомам проявления на различных органах дерева (Бактериальные болезни растений, составители Ягудин В.Д. и Шкляр С.Н.,М., Колос 1979 г. С. 213-231). Недостатком известного способа является то, что симптомы бактериального ожога на плодовых культурах сходны с другими болезнями, такими как бактериальный некроз, вертициллез, фузариоз,альтернариоз, а также вызываемыми абиотическими факторами - недостаток влаги или переувлажнение,резкие перепады температур, токсические вещества,нарушение режима питания (избыток или недостаток микро- и макроудобрений). Недостатком этого способа является то, что выявить и установить бактериальный ожог на основании симптом не всегда возможно. Для проведения карантинных мероприятий необходима точная диагностика. Известен способ диагностики карантинного заболевания плодовых культур бактериального ожога, который основан на специфической реакции антиген-антитело. Антиген - эго исследуемая фитопатогенная бактерия, антитело - это сыворотка,которую готовят соответствующие учреждения или лаборатории(Методические указания по диагностике и мерам борьбы с бактериальным некрозом и ожогом плодовых культур. Составители Гвоздяк Р.И., Матвеева Е.В.,Чумаевская М.А., М., 1987. С. 22-26). Недостатком данного способа диагностики является необходимость изолировать из пораженных органов путем бактериологических анализов чистую культуру фитопатогенной бактерии. Из-за изобилия сопутствующей микрофлоры сложно выделить истинного возбудителя в чистую культуру. Кроме того, нужно всегда иметь соответствующую дорогостоящую сыворотку. Известен способ диагностики бактериальных болезней с помощью электронной микроскопии. Для этого используют электронный микроскоп марки ЭВМ-100 М. При этом можно диагностировать бактерии, их форму, размеры и характер жгутикования. На основании этих морфологических признаков определяют их родовую принадлежность(А.М. Лазерев Диагностика бактериозов сахарной свеклы и меры борьбы с ними, Санкт-Петербург,2008 г, С 54-55). Недостатком данного способа является необходимость изолировать из пораженных органов чистую культуру фитопатогенной бактерии путем бактериологических анализов. Кроме того, нужен дорогостоящий электронный микроскоп и обслуживающий его персонал. 2 Известен способ диагностики бактериальных болезней путем реакции сверхчувствительности на индикаторном растении пелоргония - комнатной герани (.), инфекционноинфильтрационным методом Клемента. В качестве инокулюма используют вытяжку из пораженных органов растений (Инновационный патент РК 25794 П А 01 С 1/00 А 01 63/00 Способ диагностики бактериальных болезней растений). Недостатком данного способа является то, что плодовые деревья поражаются двумя видами бактериоза - некрозом и ожогом, которые сходны между собой по внешним признакам болезни и оба вызывают реакцию сверхчувствительности на индикаторном растении комнатной герани. В связи с этим, различить их очень трудно. Один из них,бактериальный ожог, является карантинным для республики объектом. Известен способ диагностики карантинного заболевания плодовых культур бактериального ожога путем изолирования чистой культуры возбудителя болезни -, из пораженных органов дерева и проверить е патогенность на незрелых плодах груши методом Уайта. Незрелые плоды груши являются идеальной средой для размножения возбудителя бактериального ожога и одновременно сдерживают рост сопутствующей микрофлоры. Патологический процесс при этом протекает с обильным выделением экссудата молочно-белого цвета, особенности которого присуще только возбудителю бактериального ожога. Использование плодов груши можно с начала опадения лепестков завязи и до двух недель до их созревания. Собранные в конце июня плоды можно хранить в холодильнике до 6 месяцев и использовать в конце лета и начале осени,когда идет усиленное сокодвижение(Джаймурзина А.А., Исин М.М., Умиралиева Ж.З. Изоляция и идентификация возбудителя бактериального ожога плодовых культур на юге и юго-востоке Казахстана. Защита растений и экологическая устойчивость агробиоценозов. Материалы Международной научной конференции. Алматы, 2014. С. 389-391). Недостатком данного способа является необходимость изолирования из пораженных органов фитопатогенной бактерии в чистую культуру. Для таких бактериологических анализов требуется специальная подготовка (специалист бактериолог). Бактериологический анализ очень трудоемкий и длительный процесс, требует строгих асептических условий. Длительность процесса заключается в подготовке и стерилизации посуды, инструментов для анализов, подготовка питательных сред и воды,их стерилизация в автоклаве проведение самих анализов в специальном помещении - боксе,длительное культивирование тест объектов (710 суток) на питательных средах в термостате затем изоляция типичных для бактериального ожога колоний на косой агар, подготовка 1-2 суточной культуры инокулюма для проверки патогенности на тест объекте. Длительность анализов может продолжиться до 15 дней. При этом при проверке патогенности на незрелых плодах груши может оказаться, что изолированная бактерия не является возбудителем бактериального ожога. При наличии в пораженной ткани множества сопутствующей микрофлоры сходных по морфологическим и культуральным признакам с бактерией, сложно выделить истинного возбудителя. Задачей изобретения является разработать способ быстрой и упрощенной диагностики карантинного заболевания плодовых культур бактериального ожога,приемлемой в производственных условиях для своевременного выявления очагов заболевания и проведения карантинных мероприятий. Технический результат - в разработанном способе диагностики карантинного заболевания плодовых культур бактериального ожога, путем инокулирования незрелых плодов груши, в качестве инокулюма используют экстракт пораженных органов дерева. Способ осуществляется следующим образом. Отбирают свежие образцы с хорошо заметными типичными признаками бактериального ожога(пораженные соцветия, завязь, молодые побеги,листья, ткань с веток, штамба и ствола). Пораженные образцы измельчают стерильным пинцетом и растирают в стерильной фарфоровой ступке с небольшим количеством стерильной воды(11) и инокулируют ими незрелые плоды груши. Плоды груши предварительно тщательно промывают с мылом в проточной воде,ополаскивают 70 спиртом, затем стерильной водой. Подготовленные плоды помещают во влажные камеры в полиэтиленовые коробочки,увлажненные стерильной фильтровальной бумагой. Подготовленный растительный экстракт наносят на поверхность плодов груши, затем в этом месте три раза накалывают стерильной энтомологической булавкой на разную глубину, накалывание повторяют несколько раз, за тем на это место еще раз наносят растительный экстракт. После инокуляции поверхность влажных камер закрывают полиэтиленовой пленкой и помещают в термостат при температуре 25-26 С. Через двое суток в местах инокуляции наблюдается некроз с выделением грязно-белого экссудата. Этот метод является одним из основных при диагностике возбудителя бактериального ожога. Следовательно, данный образец содержит бактерию,возбудителя бактериального ожога плодовых культур. В эталоне (прототип) образцы тщательно промывают в течение 5 минут под струей водопроводной воды, затем трижды в стерильной воде в стерильных бюксах и растирают в стерильных фарфоровых ступках с небольшим количеством стерильной воды, делают серию разведений в пробирках со стерильной водой 110 1100 11000. Затем стерильными пипетками помещали 1-2 капли из каждого разведения в чашки Петри с предварительно разлитой питательной средой - картофельно-глюкозный агар (КГА) и тщательно растирают стерильным шпателем Дригальского. Для получения редкого посева тем же шпателем проводят по поверхности второй и третьей чашки. Для каждого образца используют по 9 чашек Петри с питательной средой. Затем их помещали в термостат и культивируют в течение 710 суток, при этом следили за ростом колоний бактерий. За этот период у них четко формируются основные морфологические признаки (размер,форма, профиль, консистенция, структура, цвет,края). После этого по форме, цвету, размеру и структуре характерных для фитопатогенной бактерииотсевают на косой агар с питательной средой. Для проверки патогенности из изолированных бактерий готовили 2-х суточную культуру путем пересева на другие косячки, из которых готовят титр инокулюма 109. Приготовленным инокулюмом заражают незрелые плоды груши аналогично опытному варианту. Через двое суток в местах заражения выделяется грязно-белый экссудат, что указывает,что исследуемая бактерия является возбудителем бактериального ожога. Таким образом, в обоих случаях диагностики, в варианте с экстрактом больных образцов дерева и в прототипе с чистой культурой фитопатогенных бактерии, на тест объекте незрелых плодах груши через двое суток выделяется грязно-белый экссудат, что свидетельствует о поражении анализируемых образцов бактериальным ожогом (фиг.1). Фиг.1 - Инокуляция незрелых плодов груши методом Уайта,образование грязно-белого экссудата а) чистая культура возбудителя бактериального ожога б) экстракт пораженных бактериальным ожогом органов растений Использование предлагаемого изобретения позволит провести быструю диагностику бактериального ожога в производственных условиях, своевременно провести карантинные мероприятия и предотвратить дальнейшее распространение болезни. Предлагаемый способ имеет ряд преимуществ перед известными способами 1. Позволит достаточно эффективно и быстро выявить очаги бактериального ожога. 2. Протестировать саженцы и прививочный материал, привезенные из других регионов,сопредельных стран и дальнего зарубежья на зараженность бактериальным ожогом. 3. Своевременно провести диагностику службами фитосанитарии и карантина на местах на свежих образцах, пораженных болезнью, при отсутствии дорогостоящего оборудования и реактивов. При длительной транспортировке и неправильном хранении, возбудитель болезни может погибнуть, что приведет к неточной диагностике. 4. Снимает необходимость проведения трудоемких и длительных бактериологических анализов. 3 5. Позволит своевременно провести карантинные мероприятия и предотвратить дальнейшее распространение болезни. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики карантинного заболевания бактериального ожога на плодовых культурах,включающий определение патогенности путем образования грязно-белого экссудата при инокуляции незрелых плодов груши,отличающийся тем, что в качестве инокулюма используют экстракт пораженных органов дерева.