Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. – используемый для получения моноклональных антител к препарату сердечного тропонина I

(51) 12 1/20 (2006.01) 61 39/40 (2006.01) 12 5/12 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Технической задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующего МКА к препарату сердечного тропонина . Полученный штамм обозначают 3310, который хранится в РГП на ПХВ Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности КН МОН РК под регистрационным номером М-12-14/. Активность моноклональных антител проверяли в непрямом варианте ИФА. Титры моноклональных антител секретируемые штаммом гибридомы 3310 составляют по ИФА в культуральной жидкости 11024, в асцитной жидкости 125600. Концентрация белка в культуре клеток составляет 40 мкг/мл, в асцитной жидкости - 2 мг/мл. Моноклональные антитела могут быть использованы в качестве основных реагентов в создании иммуннохроматографической тест системы для выявления белков-биомаркеров повреждения миокарда в крови человека.(72) Боровиков Сергей Николаевич Куйбагаров Марат Амангельдыевич Сыздыкова Альфия Сафиоллаевна Картабаева Гаухар Омарбековна(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(56) Катруха А.Г. Диссертация доктора биологических наук. Москва, 2000, с. 251(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ. - ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ПРЕПАРАТУ СЕРДЕЧНОГО ТРОПОНИНА(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в разработке тестов для серологической диагностики инфарктного состояния человека. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в разработке иммуноферментных и иммунохроматографических тестов для диагностики острого инфаркта миокарда человека. В настоящее время диагностика инфаркта миокарда основывается на трех критериях 1) анамнез и физикальное обследование 2) данные инструментальных исследований 3) определение в крови кардиомаркеров белков, специфичных для инфарктного состояния. Данные анамнеза заболевания и физикального обследования являются по существу субъективными и не могут служить критериями диагностики инфаркта миокарда. Целью физикального обследования является в первую очередь исключение внесердечных причин боли в грудной клетке(плеврит,пневмоторакс,миозит,воспалительные заболевания костно-мышечного аппарата, травмы грудной клетки и др.). Известно использование миоглобина как раннего маркера некроза миокарда при изготовлении диагностического теста, позволяющее получить высокую чувствительность теста на самых ранних стадиях развития острого инфаркта миокардаМ..-1998. 272(1). - С. 69-77. Известно использование сердечного белка,связывающего жирные кислоты, в качестве биомаркера при ранней диагностике острого инфаркта миокарда Рябов В.В., Суслова Т.Е.,Марков В.А. Бюллетень СО РАМН. - 2005. -3. С. 26-29. Наиболее близким к предлагаемому изобретению является штамм гибридных культивируемых клеток,продуцирующих специфические антитела к тропонину. Синтезируемые штаммом моноклональные антитела (МКА) не реагируют с другими белковыми биомаркерами некроза сердечной мышцы Катруха, Алексей Генрихович,дис. доктора биологических наук.- Москва, 2000,251 с Предлагаемый штамм гибридных культивируемых клеток отличается от аналога тем,что получен в результате гибридизации иммунных спленоцитов линейной мыши иммунизированной рекомбинантным препаратом сердечного тропонина(, тогда как при создании аналога использовался нативный препарат тропонина . Специфичность моноклональных антител к препарату сердечного тропонина ,продуцируемые штаммом гибридомы 3310 по результатам иммуноблоттинга соответствует антигенной детерминанте молекулярной массой 26 кДа. Технической задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующих моноклональные антитела к препарату сердечного тропонина . Продуктивный клон гибридомы, обозначенный как 3310 депонирован в РГП на ПХВ Научно-исследовательский институт проблем 2 биологической безопасности КН МОН РК (080409 Жамбылская обл.,Кордайский-он,пгт Гвардейский) под регистрационным номером 0906/718 и характеризуется следующими признаками. Штамм получают следующим образом. Мышам линии / в первый день иммунизации внутрибрюшинно вводят 100 мкг препарата сердечного тропонинав 0,1 мл полного адъюванта Фрейнда. На 14, 28 и 42-й дни иммунизации животным инъецируют по 100 мкг этого же антигена с неполным адъювантом Фрейнда. Спустя 4 дня после последней иммунизации извлекают селезенку мышей, которые имеют высокие титры антител в сыворотке крови по результатам твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА). Клетки селезенки (В-лимфоциты) иммунных мышей в количестве 1107 гибридизируют с клетками миеломы Х 63-8-563(1106) в 1 мл неполной питательной среды,содержащей 45 полиэтиленгликоль с молекулярной массой 4000 и 10 диметилсульфоксид. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля их высевают в ячейки 96-луночной панели на слой перитонеальных макрофагов мыши. На следующий день в эти лунки вносят селективную питательную среду, содержащую гипоксантин-аминоптеринтимидин (ГАТ). Через 10-14 дней после слияния из лунок, имеющих колонии клеток размером 2-3 мм,отбирают культуральную среду, содержащую антитела для определения продуктивности гибридных клеток. Тестирование проводят методом ТИФА с использованием препарата сердечного тропонина,являющегося биомаркером повреждения миокарда и кроличьих иммуноглобулинов к антителам мыши, меченых пероксидазой хрена. В течение 21 дня после слияния, гибридные клетки культивируют на селективной среде (ГАТ) и затем постепенно переводят на среду, содержащую гипоксантинтимидин (ГТ) и полную среду -1640. Клоны гибридных клеток, продуцирующих МКА к препарату сердечного тропонина , дважды клонируют методом лимитирующих разведений. После второго клонирования 95 субклонов должны продуцировать антитела к тестируемому антигену. Морфологические признаки. Гибридные клетки представляют собой слабо прикрепляющиеся к носителю округлые клетки размером с исходную миеломную клетку. Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка. Культуральные признаки. Гибридные клетки адаптированы к росту в среде -1640,содержащую инактивированную нагреванием сыворотку эмбриона коров (10-20) 20 мл/л 200 мМ-глютамина- 3,375 г/л 2-меркаптоэтанола 0,003 мл/л 10 мл/л пирувата натрия бикарбоната натрия - 3,7 г/л. Клетки культивируют в пластиковых матрацах при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Характер роста - стационарная суспензия. Посевная концентрация 2106 клеток в 1 мл. Рост клеток ведут до достижения плотности монослоя в пределах 75-80 или концентрации клеток не выше 0,5 х 106 в 1 мл. Частота пассирования 3-4 суток. Продуктивность штамма. На 3-4-й день культивирования гибридомы концентрация МКА составляет 0,035-0,040 мг/мл в культуральной среде и 4-8 мг/мл в очищенной асцитной жидкости. Титры иммуноглобулинов в ТИФА по отношению к исходному антигену составляют в культуральной жидкости - 11024, в асцитной жидкости - 125600. Характеристика полезного продукта. МКА относятся к иммуноглобулинам класса / Константа связывания 2 х 10-9 М. Способы оценки специфичности МКА ТИФА. Контаминация. Контаминация бактериями,грибами и микоплазмами не обнаружена. Криоконсервирование. Гибридные клетки снимают с матраца мягким пипетированием и переносят в отдельные центрифужные пробирки. Осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 6-8 мин. К осадку гибридных клеток добавляют сыворотку плода коровы (0,9 мл), а затем диметилсульфоксид до конечной концентрации 10. Суспензию гибридных клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающими крышками по 1 мл (1-5 х 106 кл.),помещают в коробку из пенопласта и переносят в низкотемпературный холодильник при -70 С на 1618 часов. Затем ампулы с гибридными клетками переносят в контейнеры с жидким азотом (-196 С). Условия размораживания. Ампулу с гибридными клетками вынимают из сосуда с жидким азотом и помещают в водяную баню, нагретую до 37 С. Как только растают кусочки льда, суспензию гибридных клеток переносят в отдельную стерильную центрифужную пробирку, содержащую 10 мл холодной неполной ростовой среды, отмывают один раз путем центрифугирования в течение 6-8 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют,осадок клеток ресуспендируют в полной ростовой среде, нагретой до комнатной температуры, и высевают в ячейки 24-луночного планшета с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Штамм гибридомы 3310 используют следующим образом. Пример 1. Гибридные клетки высевают в пластиковые матрацы площадью 25 см 3 по 5105 клеток в 5 мл ростовой среды и инкубируют 3-4 дня при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Культуральную среду собирают и центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин с целью отделения клеток от надосадочной жидкости, содержащей антитела. Для наработки препаративного количества МКА осадок гибридных клеток разводят неполной ростовой средой в объеме 0,5 мл и вводят внутрибрюшинно (в концентрации 1-2 млн. клеток) мышам линии(2,6,10,14-тетраметилпентадексан). Через 10-14 дней после прививки гибридных клеток мышей забивают путем цервикальной дислокации, стерильным шприцом отсасывают асцитную жидкость, вводя иглу в брюшную полость. Асцитную жидкость собирают в центрифужные пробирки и очищают от гибридных клеток центрифугированием в течение 6-8 мин при 1000 об/мин. Очистку МКА осуществляют методом высаливания насыщенным раствором сульфата аммония. Специфичность определяют в ТИФА с использованием исходного препарата сердечного тропонина , близкородственных и гомологичных антигенов. Для проведения ТИФА на 96-луночный полистироловый планшет сорбируют препарата сердечного тропонинав концентрации 0,5 мкг/мл в 100 мкл забуференного физиологического раствора(ЗФР),7,2-7,4. Инкубируют при 4 С в течение ночи или 2 часа при 37 С. Затем планшет отмывают 3 раза ЗФР с 0,05-ным твином-20 (ЗФР-Тв) и 3 раза ЗФР. В лунках вертикальных рядов планшета готовят двукратные разведения исследуемой культуральной жидкости (КЖ) или асцитной жидкости (АЖ) начиная с разведения 1100 и выше в 0,1 мл ЗФР-Тв. Одновременно ставят контроли с культуральной жидкостью миеломных клеток в тех же разведениях и с ЗФР-Тв. Затем планшет накрывают крышкой и инкубируют в термостате при 37 С в течении 1 часа. После инкубации содержимое лунок удаляют, повторяют процедуру отмывки планшета и в каждую лунку вносят по 0,1 мл рабочего разведения конъюгата (антитела кролика против иммуноглобулинов мыши,меченные пероксидазой) в ЗФР-Тв. Через 1 час после инкубации при 37 С повторяют процедуру отмывки планшета и в каждую лунку вносят по 0,1 мл свежеприготовленной субстратной смеси(5 мг ортофенилендиамина растворяют в 10 мл 0,05 М цитратно-фосфатного буфера,4,5 и добавляют 0,025 мл 3-ного перекиси водорода). Затем планшет накрывают крышкой и оставляют в темном месте при комнатной температуре. Через 1015 мин экспозиции реакцию останавливают путем внесения в каждую лунку по 0,1 мл 0,5 М раствора 2 О 4. Результаты реакции учитывают на спектрофотометре путем измерения оптической плотности жидкости в каждой лунке при длине волны 492 нм. Положительная реакция характеризуется появлением в лунках темнокоричневого окрашивания реакционной жидкости,при отрицательной реакции - содержимое лунок остается совершенно бесцветным или имеет светложелтое окрашивание. Титром моноклональных антител считают их максимальное разведение,величина оптической плотности в котором в 2 и более раза превосходит оптическую плотность в лунках с отрицательным контролем. Результаты опыта по определению специфичности МКА в ТИФА представлены в таблице 1. Таблица 1 Титры МКА Культуральная Асцитная жидкость жидкость Виды антигенов Растворимые антигены Препарат сердечного тропонинаМиоглобин Примечание - РО - реакция отрицательная. Как видно из приведенных в таблице 1 результатов, полученные моноклональные антитела проявляют высокую активность к препарату сердечного тропонина . Так как при этом они не реагируют с препарату сердечного тропонина Т можно сделать заключение о специфичности данных МКА к исходному антигену. Таким образом,результаты опыта свидетельствуют о специфичности моноклональных антител, продуцируемых штаммом гибридных клеток 3310 к препарату сердечного тропонина ,что позволяет получать на их основе эффективные препараты для экспресс-диагностики острого инфаркта миокарда людей. Пример 2. Электрофорез проводят в 10 полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) на аппарате для вертикального электрофореза. Электрофорез проводят при силе тока 20 мА и напряжении 220 в. Электрофоретический перенос препарата сердечного тропонинаиз геля на нитроцеллюлозную мембрану осуществляют с помощью прибора для иммуноблотинга. Перенос проводят при постоянной силе тока 0,8 мА/см геля в течение одного часа. Для иммунохимического проявления специфических антигенов нитроцеллюлозную мембрану сначала инкубируют в 1 растворе бычьего сывороточного альбумина(БСА) в течение ночи при 4 С. Затем отмывают по три раза ЗФР и ЗФР-Тв и выдерживают 1,5 ч при 37 С в растворе моноклональных антител гибридомы 3310 из очищенного асцитной жидкости, разведенной 1100 в ЗФР-Тв или нативной культуральной жидкости. После чего носитель вновь отмывают и инкубируют в рабочем разведении антивидовых антител,меченых пероксидазой хрена (1 ч при 37 С). Трижды повторяют процедуру отмывки и проявляют реакцию путем внесения хромогена,расщепляющего субстрат. Раствор субстрата готовят непосредственно перед использованием следующим образом 0,01 гр. 4-хлор-нафтола (, США),растворяют в 2 мл метанола, смешивают с 18 мл ЗФР. Для фиксации результатов окрашивают раствором красителя Кумасси. Результаты проведенного иммуноблоттинга показали специфичность моноклональных антител гибридомы 3310 антигенной препарата сердечного тропонинас молекулярной массой 26 кДа. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм гибридных культивируемых клеток животных/3310,депонирован в РГП на ПХВ Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности КН МОН РК под номером -12-14/, используемый для получения моноклональных антител к препарату сердечного тропонина .