Способ изготовления R-антигена для серодиагностики бруцеллеза крупного рогатого скота

(51) 61 39/10 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ может быть использовано в производстве диагностических препаратов для выявления скрытых форм течения бруцеллеза среди крупного рогатого скота. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении -антигена для серодиагностики бруцеллеза, способного выявить скрыто больных животных в стадах. Способ изготовления бруцеллезного -антигена для серодиагностики скрытых форм бруцеллеза,включающий выращивание бруцелл на питательной среде с последующим их смывом, отмыванием при 5000 об/мин, многократным замораживаниемоттаиванием после обработки детергентом и ультрацентрифугированием. В качестве бактериальной культуры используют диссоциированный штамм В. 0009/Х в(72) Сансызбай Абылай Рысбайулы Еспембетов Болат Аманбаевич Зинина Надежда Николаевна Сырым Назым Сырымкызы Кошеметов Жумагали Каукарбаевич Сармыкова Махпал Кенжеевна Нисанова Райхан Куановна Конбаева Гулшат Макседовна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ -АНТИГЕНА ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности к способам получения бруцеллезного -антигена для серодиагностики и Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности к способам получения бруцеллезного -антигена серодиагностики и может быть использовано в производстве диагностических препаратов для выявления скрытых форм течения бруцеллеза среди крупного рогатого скота. Способ изготовления бруцеллезного -антигена для серодиагностики скрытых форм бруцеллеза,включающий выращивание бруцелл на питательной среде с последующим их смывом, отмыванием при 5000 об/мин, многократным замораживаниемоттаиванием после обработки детергентом и ультрацентрифугированием. В качестве бактериальной культуры используют диссоциированный штамм . 0009/Х в-форме Сансызбай А., Еспембетов Б.А.,Зинина Н.Н., Сырым Н.С., Султанкулова К.Т.,Зайцев В.Л., Сармыкова М.К., Нисанова Р.К. Инновационный патент 27979. Культуру выращивают на твердой питательной средеМ 074, смывают, фильтруют и трижды отмывают дистиллированной водой путем центрифугирования при 5000 об/мин в течение 30 мин, полученную надосадочную жидкость удаляют,а осадок ресуспендируют дистиллированной водой, доводят до 50 млрд. микробных клеток в 1 см 3 по бруцеллезному стандарту мутности затем добавляют детергенттритон Х-100 и инактивируют в водяной бане при температуре 96 С с экспозицией в течение 1 ч, далее микробные клетки разрушают путем замораживания(-60) и оттаивания (37,5 С) от 12 раз. После последнего оттаивания взвесь центрифугируют при 18 000 об/мин в течение 30 мин, доводятдо 7,0-7,2, надосадочную жидкость используют в качестве- антигена. Известен способ получения цветного антигена из-форм бруцелл для пробирочной реакции аглютинации при диагностике инфекционного эпидидимита баранов, включающий выращивание бруцелл на питательной среде с последующим их смывом,отмыванием,суспендированием,окрашиванием, ресуспендированием в буферном разбавителе и стандартизацию Барамова Ш.А.,Султанов А.А., Мырзалиев А.Ж., Оспанов Е.К. Инновационный патент 24675, от 17.10.2011. Недостатком данного метода является то, что применение названного метода выявляет не всех зараженных животных. В отличие от известного способа, предлагаемый-антиген изготавливают из актуального для Казахстана штамма В. 0009/Х в - форме,предназначенный для довыявления скрытых форм бруцеллеза крупного рогатого скота. Задачей изобретения являются получение антигена из штамма . 0009/Х для серодиагностики бруцеллеза крупного рогатого скота. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении -антигена для серодиагностики бруцеллеза, способного выявить скрыто больных животных в стадах.-антигена характеризуется следующими признаками Морфологические признаки. Бактерии штамма грамотрицательные,овоиды,красные от 0,4-2,50,4-0,6 мкм,неподвижные,специализированные клетки не образуют. Культуральные свойства. На эритрит агаре с добавками вырастают янтарные, прозрачные,плотные, гладкие, поверхность блестящая. Штрих посев имеет матовый оттенок, бактериальная масса с трудом снимается бактериологической петлей. Накопление бактериальной массы наблюдается через 48-72 ч выращивания. В питательном бульоне образуют равномерную муть с пристеночным кольцом. Аэроб. Оптимальная температура выращивания 37,5 С при 6,8-7,0. Биохимические свойства. Обладает каталазной активностью. Антигенная структура. Содержит типичный набор антигенных детерминант, характерных дляв -форме. Главным антигенным отличием является отсутствие у -вариантов полисахаридной цепи-эндотоксина,где антигенными детерминантами, являются структуры альфа-2-маннопиранозы. Патогенные свойства. При определении вирулентности по методу Коротича-Галота установлено, что штамм 0009/Х имеет слабую вирулентность. Способ получения -антигена состоит в следующем Пример 1. Трехсуточную культуру . в форме из колб Тартаковского смывают стерильной дистиллированной водой в стерильные емкости из нейтрального стекла. Затем бактериальную массу фильтруют, трижды отмывают дистиллированной водой путем центрифугирования 5000 об/мин в течение 30 мин. Полученную надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют дистиллированной водой, доводят до 50 млрд. микробных клеток в 1 см 3 по бруцеллезному стандарту мутности, затем добавляют детергент тритон Х-100 и инактивируют в водяной бане при температуре 96 С с экспозицией в течение 1 ч,доводятдо 7,0-7,2 и используют в качестве- антигена. Пример 2. Проверку на стерильность препарата осуществляют путем посева на плотную питательную средуМ 074, далее помещают в термостат при 37,5 С на 10 сут. При этом на поверхности питательной среды рост бактерий отсутствовал. Пример 3. Изучение диагностической эффективности бруцеллезного- антигена путем исследования сывороток крови, экспериментально зараженных морских свинок культурами . виформе. При изучении диагностической эффективности антигена путем исследования сывороток крови,экспериментально зараженных морских свинок культурами . виформе формируют 5 групп морских свинок по 5 голов в каждой. Животных 1-ой группы заражают В. 0009/Х в- форме, 2-ой группы - В. 544 в -форме, 3 ей группы - В. 19 в -форме , 4-я группа В. -51 в -форме и 5-я группа - контроль. Серологические исследования (РСК, РБП) сывороток крови морских свинок проводят после заражения и на 30-й день животных подвергают эфтаназии для дальнейшего бактериологического исследования органов (печень, почка, селезенка),лимфатических узлов (заглоточный, нижнешейный,параортральный, правый и левый паховые) и костного мозга. Результаты исследований,представленные в таблице 1, свидетельствуют о том,что предлагаемый опытный -антиген обладает более высокой диагностической эффективностью в 1 и 2 группах экспериментальных морских свинок зараженных В. 009/Х и В. -51 в- форме по сравнению с коммерческим антигеном. Пример 4. Изучение специфичности антигена проводили серологические исследования со специфичными позитивными и негативными сыворотками от следующих инфекций .,., ., -агглютинирующая бруцеллезная,позитивная бруцеллезная-сыворотка и негативная бруцеллезная сыворотка. Результаты изучения специфичности разработанного-антигена представлены в таблице 2. Согласно результатам из таблицы 2 разработанный -антиген специфично реагирует с-агглютинирующей бруцеллезной сывороткой,тогда как с другими специфичными сыворотками не дает перекрестных реакций. Таким образом, разработанный опытный-антиген из штамма . 0009/Х в -форме для серологической диагностики бруцеллеза,дополнительно довыявляет инфицированных животных в -форме бруцелл. Таблица 1. Результаты серологических и бактериологических исследований опытным и коммерческими антигенами у морских свинок при экспериментальном скрыто протекающем бруцеллезе. Результаты серологических исследовании- антиген Коммерческийантиген РСК РБП РСК Результаты изучения специфичности разработанного- антигена Серологические исследования РСК РДСК 3-агглютинирующая бруцеллезная сыворотка Позитивная бруцеллезная -сыворотка Негативная бруцеллезная сыворотка ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ-антигена для серодиагностики бруцеллеза крупного рогатого скота, включающий выращивание бруцелл на питательной среде с последующим их смывом,отмыванием, суспендированием и стандартизацией,отличающийся тем, что в качестве бактериальной культуры используют штамм В.0009/Х в-форме, который выращивают на твердой питательной средеМ 074, смывают, фильтруют и трижды отмывают дистиллированной водой путем центрифугирования 5000 об/мин 30 мин, полученную насадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют дистиллированной водой, доводят до 50 млрд. микробных клеток в 1 см 3 по бруцеллезному стандарту мутности, добавляют детергент-тритон Х 100, инактивируют в водяной бане при температуре 96 С с экспозицией в течение 1 ч, доводят 7,0-7,2 и используют в качестве -антигена. Серологические исследования РСК РДСК