Способ получения тритерпеноида из растительного сырья, обладающего антидиабетического действием

(51) 61 36/00 (2006.01) 61 3/10 (2006.01) 11 9/02 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к области получения биологически активных природных соединений, в частности к способу получения тритерпеноида,обладающего антидиабетическим действием. Техническим результатом предлагаемого способа является расширение арсенала отечественных лекарственных средств, переработка растительного сырья и получение биологически активного вещества,обладающего антидиабетическим действием. Технический результат обеспечивается путем экстракции растительного сырья органическим растворителем, упаривания и очистки на колонке с силикагельным сорбентом. Антидиабетическая активность (фермент глюкозидаза) испытана на терпеноиде, выделенном из надземной массы. (-11).(72) Чаудхари Игбал МухаммедАбилов Жарылкасын АбдуахитовичОрманбаева Амангуль МамыржановнаСултанова Нургуль АдайбаевнаУмбетова Алмагуль Кендебаевна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Казахский национальный университет им. аль-Фараби Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРИТЕРПЕНОИДА ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ,ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИДИАБЕТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЕМ Изобретение относится к области получения биологически активных природных соединений, в частности к способу получения тритерпеноида,обладающего антидиабетическим действием. Известен способ переработки бересты с получением тритерпеноидов (Патент РФ 2283655,МПК 6 А 61 36/00, опубл. 20.09.2006 г., бюлл. 26). Способ осуществляется полярным экстрагентом при соотношении береста растворитель - 13-120 при температуре 18-100 С в течение 0,5-20 часов. Отделение фильтрованием концентрата водорастворимых веществ, который может быть сконцентрирован или переведен в сухое состояние. Бересту повторно экстрагируют полярным органическим растворителем при соотношении 110 - 120 соответственно. Экстракт отделяют,концентрируют и выделяют кристаллизацией концентрат бетулинола с содержанием основного компонента не менее 10,4-12,2. Затем из маточного раствора полностью отгоняют растворитель и получают концентрат тритерпеноидов,основными компонентами которого являются бетулинол и лупеол. Недостатком способа является то,что перерабатывается только береста, а также низкий выход бетулина из бересты (известно, что береста содержит до 30-35 бетулина). Известен способ получения тритерпеновых соединений переработкой березовой коры (Патент РФ 2305550, МПК 6 А 61 36/13, опубл. 10.09.2007 г.,бюлл. 25),включающий последовательное измельчение коры в дробилке разделение ее на бересту и луб экстракцию бересты растворителем в виде азеотропной смеси тетрахлорэтилен - вода в течение 0,5-1,4 часа при температуре 89-115 С, давлении 0,1-1,0 МПа отделение раствора от шрота при температуре 80100 С выдерживание фильтра в кристаллизаторе в течении 1-5 часов при температуре от -5 С до 25 С отделение выпавших кристаллов от маточного раствора промывание кристаллов дистиллированной водой или 20-ным водным раствором этилового спирта с последующей сушкой полученного продукта смеси трех-пяти тритерпеновых соединений упаривание маточного раствора до получения сухого остатка промывание его дистиллированной водой с последующей сушкой полученного продукта - смеси пятисемнадцати тритерпеновых соединений. Шрот далее перерабатывают в лигнин и березовый воск, а луб в квас и кормовую добавку. Недостатком способа является необходимость предварительного разделения коры на бересту и луб, что является достаточно трудоемким процессом. Весь процесс переработки бересты и луба предусматривает большое количество дополнительных операций и продолжителен во времени. При переработке бересты смесь тритерпеновых соединений, основным из которых является бетулин, получают в два этапа и с низким выходом. Кроме того, к недостаткам способа следует отнести недостаточный ассортимент получаемых лесохимических продуктов. 2 Наиболее близким аналогом к предложенному способу является способ получения смеси тритерпеноидов из растительного сырья коры березы (Патент РФ 2352350, МПК 6 А 61 36/185,опубл. 20.04.2009 г., бюлл. 11). Кору березы измельчают до частиц размером 1-3 мм и подвергают экстракции неполярным растворителем(гексаном, бензином БР-1, толуолом, петролейным эфиром,диэтиловым эфиром),а также галогенпроизводным углеводородом для выделения тритерпеновых соединений в аппарате Сокслета. Далее с целью выделения бетулина тритерпеноиды кипятят в 20-ном водном растворе щелочи в течение 1,5-2,0 часов, затем проводят экстракцию коры при 75-80 С водно-спиртощелочным раствором с концентрацией гидроксида натрия 1,5 и этанола 15-20 в течении 1-1,5 ч и получают дубильный экстракт. Остаток коры подвергают карбонизации в реакторе кипящего слоя с получением углеродного сорбента. Выход бетулина составляет 9,5 от веса абсолютно сухой коры,температура плавления полученного бетулина после перекристаллизации из этилового или изопропилового спирта - 256-258 С. Недостатком способа является то,что переработка растительного сырья предусматривает большое количество дополнительных операций и продолжительна во времени. Задачей настоящего изобретения является разработка способа выделения тритерпеновых соединений из растений рода(.),обладающего антидиабетическим действием. Техническим результатом предлагаемого способа является расширение арсенала отечественных лекарственных средств, переработка растительного сырья и получение биологически активного вещества,обладающего антидиабетическим действием. Технический результат обеспечивается путем экстракции растительного сырья органическим растворителем, упаривания и очистки на колонке с силикагельным сорбентом. Пример 1. Мелкоизмельченное сырье (надземная масса - стебли, листья) заливалось 70-ным водным раствором этилового спирта и настаивалось в течение 3 дней. Водно-спиртовый экстракт отфильтрован и концентрирован под вакуумом водоструйного насоса при температуре водяной бане не выше 45 С до полного удаления спирта. Полученный водный экстракт(0,5 л) последовательно обработан хлороформом,этилацетатом, для предварительного разделения веществ в зависимости от их растворимости. В результате получены хлороформные, этилацетатные экстракты и водный раствор исследуемого вида сырья. В хлороформном экстракте исследуемых видов растений реакцией Либермана-Бурхарда и методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) (проявитель идентифицированы тритерпеноиды. 4,Хлороформный экстракт растворяют в минимальном количестве чистого метанола и смешивают с силикагелем (СГ), высушивают в вакуумном эксикаторе на СаС 2 Образовавшиеся массы измельчают и получают порошок коричневого цвета, которые вносят в колонку с СГ. В качестве системы растворителей используют гексан-ацетон с повышением градиента полярности последнего. При элюировании колонок чистым гексаном смываются липофильные вещества и хлорофиллы, жирные кислоты. Качественный и количественный состав жирных кислот в исследуемых видах растений проанализирован методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Далее, увеличивая концентрацию ацетона, получают фракции 4-8. В последующих фракциях 9-18 19-30 из колонок методом ТСХ обнаружены терпеноиды(бордовое окрашивание пятен после проявления сульфатом церия). Повторным хроматографированием на СГ данных фракций в индивидуальном состоянии выделено вещество 1. Схема способа получения тритерпеноида представлена на фиг.1. Вещество 1 - аморфный порошок белого цвета с температурой плавления 198-200 С, отнесено к пентациклическим тритерпеноидам (фиолетовое окрашивание с сульфатом церия и положительная реакция с реактивом Либермана-Бурхарда). В результате щелочного гидролиза обнаружен агликон с температурой плавления 270-272 С и фенолокислота - температура плавления 202-205 С,идентифицированные методом бумажной хроматографии (БХ) и ТСХ с достоверными образцами как эпиалеуритоликовая и кофейная кислоты,соответственно. Физико-химические характеристики вещества 1 приведены в таблице 1. Следует отметить, что вещество 1 на основании физико-химических методов исследования идентифицировано с известным веществом 3-3,4-дигидрокси-транс-циннамоил-окси-Дфридоолеан-14-ен-28-овой кислотой изотамариксеном. Физико-химические характеристики соответствуют литературным данным. Структурная формула вещества 1 представлена на фиг.2. Таблица 1 Физико-химические характеристики вещества 1 Вещество Спектральные характеристики 33,4 Масс-спектр, м/е,617 (20.0), 438 (37.2), 248 (17.2), 204 (33.8),дигидрокси-транс 189 (23.3), 133 (21.2). ЯМР 1 Н (500 МГц, 33, , м.д., /Гц) 1.30 (2 Н, м, Н-1), 1.98 циннамоил-оксиД-фридоолеан-14(2 Н,м, Н-2), 4.69 (1 Н, т, 2.5, Н-3), 1.35 (1 Н, м, Н-5), 1.40 и 1.60 ен-28-овая кислота(С-26), 22.6 (С-27), 179.3 (С-28), 30.0 (С-29), 30.1 (С-30), 167.0 (С 1), 116.3 (С-2), 146.3 (С-3), 127.7 (С-1), 115.0 (С-2), 145.3 (С-3),148.6 (С-4), 117.1 (С-5), 122.3 (С-6). УФ-спектр (МеОН, , нм) 216. 245. 329. ИК-спектр (. , см-1) 3417. 1685.1603.1273. 813. Биологическая активность вещества 1 исследована в специализированном учреждении Исследовательский Институт Химии, Центр Молекулярной Медицины и Исследования Лекарств им. доктора Пэйнджвани Университета г. Карачи,Пакистан. Антидиабетическая активность (фермент глюкозидаза) испытана на биологически активном веществе 1 из надземной массы Т.аха (-11). Испытание проведены на ферменте -глюкозидазы при концентрации 30 и 60 кг/мл. В качестве стандарта использован 1-диоксинодиримицин. Данные приведены в таблице 2. Таблица 2 Антидиабетическая активность вещества 1 из надземной массы Т.аха Вещества Из приведенных данных следует, что полученное вещество 1 (-11) обладает достаточно высокой,фактически на уровне стандарта, ингибирующей активностью фермента-глюкозидазы при концентрациях 30 и 60 кг/мл. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения тритерпеноида, обладающего антидиабетическим действием,включающий экстракцию надземной массы растительного сырья 70-ным водным раствором этилового спирта,упаривание спиртового экстракта с последующей обработкой хлороформом,очистку на силикагельном сорбенте, элюацию целевого продукта смесью гексан-ацетон (73), повторным хроматографированием, удаление растворителя и высушивание, отличающийся тем, что в качестве растительного сырья используют надземную массу гребенщика рыхлого (.).