Способ оценки степени скрытой дискретной фрагментации 18s ррнк в клетках растений путем детекции 100-нуклеотидного 3′-концевого фрагмента

(51) 12 15/00 (2006.01) 12 15/10 (2006.01) 12 15/11 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к области молекулярной биологии растений, биотехнологии,генной инженерии. Достигаемый технический результат повышение специфичности и универсальности детекции скрытой дискретной фрагментации 18 рРНК в клетках растений, происходящей вследствие воздействия на растения стрессовых воздействий окружающей среды. Предлагается для оценки скрытой дискретной фрагментации 18 К растений использовать детекцию 100-нуклеотидного 3-концевого фрагмента 18 посредством Р 32-меченого или -меченного олигодезоксирибонуклетида,комплементарного тридцати пяти 3-концевым остаткам 18(5-3). Содержание данного продукта скрытой дискретной фрагментации 18 рРНК повышается более чем в 2 раза при воздействии на растения стрессовых воздействий окружающей среды, таких как тепловой шок.(72) Искаков Булат Кудайбергенович Полимбетова Найля Сейтжановна Жигайлов Андрей Викторович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ СКРЫТОЙ ДИСКРЕТНОЙ ФРАГМЕНТАЦИИ 18 рРНК В КЛЕТКАХ РАСТЕНИЙ ПУТЕМ ДЕТЕКЦИИ 100-НУКЛЕОТИДНОГО 3 - КОНЦЕВОГО ФРАГМЕНТА Изобретение к области молекулярной биологии растений, биотехнологии, генной инженерии. Оценка степени дискретной фрагментации молекулы 18 рРНК может быть использована для определения интенсивности стрессовых воздействий на растения. Известен способ оценки степени скрытой дискретной фрагментации 18 К в клетках растений путем детекции 134-нуклеотидногого 5 концевого фрагмента 18 К (5,3 РНК).621-627). Данный способ заключается в детекции молекулы 5,3 РНК в тотальных препаратах РНК,выделенных из клеток растений, с использованием Р 32-меченого зонда, комплементарного 5,3 РНК пшеницы (.). По содержанию 5,3 РНК в тотальных препаратах РНК судят о степени дискретной фрагментации молекулы 18 рРНК в составе 40 рибосомных субчастиц растений. Недостатками данного способа являются недостаточно высокая степень консервативности 5 концевого района молекулы 18 рРНК, что затрудняет точное количественное определение 5,3 рРНК с использованием одного и того же зонда в клетках растений, относящихся к различным видам слишком и большой размер зонда (более 130 нуклеотидов), что повышает шанс проявления неспецифичных взаимодействий зонда с другими молекулами РНК. Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа оценки степени скрытой дискретной фрагментации 18 в клетках растений путем детекции 100-нуклеотидного 3 концевого фрагмента. Задача достигается тем, что для оценки степени скрытой дискретной фрагментации 18 рРНК используют детекцию продукта скрытой дискретной фрагментации 18 в клетках растений, но, в отличие от известного способа, в качестве объекта детекции используют 100-нуклеотидный 3 концевой фрагмент 18 рРНК растений, а в качестве зонда-3). Дискретная фрагментация молекулы 18 рРНК может являться одной из реакций растений в ответ на стрессовые воздействия (например, тепловой шок). Во время теплового шока в клетках различных видов растений повышается содержание 100 нуклеотидного 3-концевого фрагмента 18 рРНК,который является продуктом дискретной фрагментации молекулы 18 рРНК в составе 40 рибосомных субчастиц. 3-концевой район 18 рРНК чрезвычайно консервативен у растений, поэтому зонды,комплементарные этому району 18 рРНК, могут 2 быть успешно использованы для оценки скрытой дискретной фрагментации 18 К других видов растений. Высокая консервативность 3-концевого района 18 рРНК в ряду растений позволяет использовать для детекции 100-нуклеотидного 3 концевого фрагмента 18 рРНК растений относительно короткие зонды (длиной 35 нуклеотидов), что позволяет существенно снизить вероятность неспецифических взаимодействий зонда с другими молекулами. Пример 1. В качестве примера приводится способ детекции 100-нуклеотидного 3-концевого фрагмента 18 рРНК в проращенных зародышей пшеницы, подверженных и не подверженных воздействию теплового шока, с использованием Р 32-меченого ДНК-зонда,комплементарного тридцати пяти 3-концевым остаткам 18 рРНК пшеницы. Зародыши пшеницы проращивают в присутствии 1-ной глюкозы и антибиотиков широкого спектра действия (50 Ед./мл ампициллина, 50 Ед./мл стрептомицина) при 26 С в темноте в течение 18 часов. Одну часть зародышей инкубируют при 37 С в течение 1 часа (тепловой шок), вторую часть зародышей оставляют на то же время при 26 С. Из проращенных зародышей пшеницы,подвергнутых и не подвергнутых тепловому шоку,выделяют тотальные препараты РНК с использованием тризола. Для этого 0,4 г каждого из образцов замораживают жидким азотом и растирают до гомогенного состояния. Гомогенизируют в 3,5 мл тризола, инкубируют в течение 5 минут при комнатной температуре, прибавляют по 300 мкл хлороформа, перемешивают и центрифугируют 15 минут при 20000 х . К верхней фазе прибавляют равный объм изопропанола, перемешивают и инкубируют 10 минут при 4 С. Центрифугируют 20 минут при 24000 х . Осадок промывают 70 этиловым спиртом, центрифугируют 5 минут при 20000 х , высушивают на воздухе, растворяют в денатурирующем образцовом буфере, содержащем 50 формамида. Образцы прогревают в течение 2 мин при 90 С, остужают во льду и наносят на гель. Проводят электрофорез тотальных препаратов РНК в 8 полиакриламидном геле, содержащем 8 М мочевину в 1 х трис-боратном -буфере (ТВЕ) при постоянной силе тока 8 мА. Гель окрашивают раствором бромистого этидия (1 мкг/мл) в течение 30 минут. Идентификацию полос проводят в проходящем ультрафиолетовом свете. Перенос на нейлоновую мембрану, уравновешенную в 0,1 х Трис-боратном буфере,проводят методом полусухого блоттинга при силе тока 250 мА в течение 30 минут. По окончании процедуры мембрану сушат и подвергают экспозиции УФсветом в кросслинкере в течение 1 минуты. Химическим синтезом синтезируют олигодезоксирибонуклеотид,имеющий последовательность. Проводят его фосфорилирование с помощью полинуклеотидкиназы фага Т 4 в Реакционная смесь присутствии(185/ (5000 /), 20 единиц полинуклеотидкиназы фага Т 4 и 0,5 мкмоль вышеуказанного олигодезоксирибонуклеотида. По окончании реакции меченый зонд очищают с использованием колонок с 25 фирмы( 27-5325-01) по методике производителя. Гибридизацию мембраны с Р 32-меченым зондом проводят в течение ночи в гибридизационном буфере - фирмы А ( 8663) при температуре 60 С. Мембрану отмывают от несвязавшегося зонда два раза по 20 минут в 2 х раствором(0,3 , 30 мМ цитрат натрия,0,1 с рН 7.0) при температуре гибридизации и 2 раза по 20 минут в 0,1 х(0,015 М , 1,5 мМ цитрат натрия, 0,1 с рН 7.0). Отмытую мембрану анализируют на фосфоримиджере,либо проводят ее радиоавтографирование с использованием пленки фирмы . Для оценки содержание искомого 100 нуклеотидного 3-концевого фрагмента молекулы 18 рРНК проводят денситометрический анализ полученной радиоавтограммы. Как видно из данных, приведенных на фигуре 1,содержание фрагмента Х-100, соответствующего 3 концевому фрагменту молекулы 18 рРНК, в клетках зародышей пшеницы повышается более чем в два раза при воздействии на них стрессовой температуры (37 С в течение 1 часа). Обозначения слева представлена дорожка геля с РНК-маркером(М),справа представлен радиоавтограмма мембраны, гибридизованной с Р 32-меченым зондом, комплементарным 35-и 3 концевым остаткам 18 рРНК пшеницы. 1 тотальный препарат РНК, выделенный из проращенных зародышей пшеницы,не подвергнутых тепловому шоку 2 - тотальный препарат РНК, выделенный из проращенных зародышей пшеницы, подвергнутых тепловому шоку (37 С в течение 1 часа). В таблице,представленной ниже рисунка, приведены данные денситометрического анализа, выполненного с использованием программы 1.42. Фиг.1 - Электрофоретический анализ тотальных препаратов РНК из проращенных зародышей пшеницы в 8 полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Достигаемый технический результат повышение специфичности и универсальности детекции скрытой дискретной фрагментации 18 рРНК в клетках растений, происходящей вследствие воздействия на растения стрессовых воздействий окружающей среды. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ оценки степени скрытой дискретной фрагментации 18 рРНК в клетках растений путем детекции специфических нуклеотидных последовательностей, включающий детекцию в клетках растений продукта скрытой дискретной фрагментации 18 рРНК, отличающийся тем, что в качестве объекта детекции используют 100 нуклеотидный 3-концевой фрагмент 18 рРНК растений, а в качестве зонда 32-меченый или меченный олигодезоксирибонуклеотид,комплементарный тридцати пяти 3-концевым остаткам 18 рРНК пшеницы.