Штамм вируса гриппа а/красноносый нырок/балхаш/4523/10 (h1n2), используемый для приготовления диагностических препаратов

(51) 12 7/00 (2006.01) 61 39/145 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(12) с целью приготовления на его основе диагностических тестсистем пригодных для идентификации и изучения антигенной структуры гемагглютинина вновь выделяемых изолятов вирусов гриппа А. Штамм вируса гриппа А/красноносый нырок/Балхаш/4523/101 (12) по структуре гемагглютинина близок к вирусу///0224-06/2011 (12) обладает высокой гемагглютинирующей (1512) и антигенной активностью (титр иммунной сыворотки в РТГА 11280),характеризуется термостабильным гемагглютинином, поскольку не теряет способности вызывать агглютинацию эритроцитов курицы после прогревания при 56 С в течение 120 мин.,репродуцируется в системе куриного эмбриона при оптимальной (37 С) температуре до инфекционного титра 6,8 ЭИД 50/0,2 мл., активно агглютинирует эритроциты курицы, морской свинки, кошки,лошади, барана, крупного рогатого скота и человека 0 группы. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов РГП на ПХВ НИИ проблем биологической безопасности КН МОН РК за номером депозита М-3-13/Д. Предлагаемый штамм вируса гриппа А/красноносый нырок/Балхаш/4523/10(12) может быть использован для производства диагностических препаратов, предназначенных для идентификации вновь выделенных изолятов вируса гриппа А птиц и расшифровки этиологии эпизоотических вспышек гриппа и оценки напряженности популяционного иммунитета у диких и домашних птиц.(72) Асанова Сауле Естаевна Даулбаева Клара Дакишевна Кыдырманов Айдын Исагалиевич Карамендин Кобей Омертаевич Касымбеков Ермухаммет Торебекович Жуматов Кайнар Хамзаевич Саятов Марат Хусаинович Хан Елизавета Яковлевна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт микробиологии и вирусологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Саятов М.Х. Экология и иммунология вирусов гриппа А (11), циркулирующих среди диких птиц и населения Казахской ССР // Автореф. дисс. докт. биол. наук, с.45, 1986(54) ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/КРАСНОНОСЫЙ НЫРОК/БАЛХАШ/4523/10(12),ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ(57) Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для получения специфических тест-систем для диагностики гриппозной инфекции у населения, диких и домашних птиц,а также проведения фундаментальных молекулярно-биологических исследований. Задачей изобретения является получение нового штамма вируса гриппа А/красноносый Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для получения специфических тест-систем для диагностики гриппозной инфекции у населения, диких и домашних птиц,а также проведения фундаментальных молекулярно-биологических исследований. Вирусы гриппа принадлежат к семейству, включающему 5 родов вирусы гриппа А, В, С,и . На основе антигенных различий по двум поверхностным гликопротеидам(НА) и нейраминидазе , вирусы гриппа А разделяются на различные подтипы. К настоящему времени известны 16 подтипов НА (Н 1-Н 16) и 9 подтипов(1-9), которые встречаются у диких птиц в различных комбинациях,., ..(6)-.- 2005.- .79, - 52814-2822. Недавно установлена циркуляции вируса гриппа А с новым подтипом НА (7) в популяции летучих мышей Центральной Америки,, ,,... 201213109(11)4269-74.201227. Дикие птицы водного и околоводного комплексов, являющиеся естественным резервуаром вируса гриппа А в природе, играют основную роль в процессе эволюции и сохранения возбудителя в биосфере. От них изолированы все известные в настоящее время сероварианты вирусов гриппа А,вызвавшие пандемии и эпизоотии Львов Д.К.,Ямникова С.С, Федякина И.Т. и др. Экология и эволюция вирусов гриппа в России (1979-2002 гг.)//Вопр. Вирусол.- 2004. - 3. с.17-24 Вирусы гриппа А с НА 1 характеризуются широким кругом восприимчивых видов (человек,птицы,млекопитающие животные),что обусловливает возможность преодоления ими межвидового барьера и трансмиссии к другим хозяевам. Пандемия 1918-1920 гг. испанка,унесшая более 20 миллионов жизней, вызвана вирусом с этим подтипом НА. От представителей авифауны впервые вирус гриппа А с НА 1 изолирован от дикого гуся в 1976 г. и получил название А/гусь/Гонконг/8/1976(11). Этот изолят служит эталоном при изучении вновь выделяемых штаммов. Об изоляции вируса гриппа с НА 1 от дикой утки и обнаружении антител к нему в сыворотках чаек и крачек, а также в яйцах чаек сообщили в 1979 г..,.,.,.,.// . . . . -1980. - .27, 4. - .269-277 Вирус с таким подтипом НА выделен во Франции, Нидерландах и Канаде от индеек и кур в 1998-1999 гг., в 2002 г. он изолирован от домашних уток в Дании вспышки гриппа 11,12 отмечены также в популяциях домашних уток в Италии в 2002-2003 гг.2, ,, 2002-2006 // . 2007. -. 50. -. 161-166 Кроме птиц, вирус гриппа 2 с М геном свиной линии изолирован в 2010 г. в США (штат Айова) от норок, погибших от тяжелой формы респираторной инфекции с геморрагической пневмонией. Секвенирование генов вирусов гриппа(11) 1918 г. и современных его вариантов указывает на то, что они подвергаются небольшим антигенным изменениям в организме своих природных хозяев даже в течение длительного периода времени,,А.Н.. 19171918. -2002. - .76, - .78607862. . Известен изолят А/гусь/Гонконг/8/1976 (11),идентифицированный как вирус гриппа 11. Известен также изолят А/свинья/Гуандонг/1/10,идентифицированный как вирус гриппа 2 в 2010 г. В Казахстане вирусы гриппа(11), в антигенном отношении сходные с эпидемическими вариантами 1950-1952 гг. и 1977-1978 гг., выделены в 1979-1980 гг. от озерных и серебристых чаек,чирков-трескунков, лысух, юрков, широконосок и ворон Саятов М.Х. Экология и иммунология вирусов гриппа А(Н 11), циркулирующих среди диких птиц и населения Казахской ССР //Автореф. дисс. докт. биол. наук. - 1986.с.45. Задачей изобретения является получение нового штамма вируса гриппа А/красноносый нырок/Балхаш/4523/10(12) с целью приготовления на его основе диагностических тестсистем пригодных для идентификации и изучения антигенной структуры НА вновь выделяемых изолятов вирусов гриппа А. В 2010 г. в Балхашском районе Алматинской области (устье реки Или) из клоакального смыва красноносого нырка изолирован штамм вируса гриппа А/красноносый нырок/Балхаш/4523/10,антигенно близкий к эталону А/гусь/Гонконг/8/1976(2), с иммунной сывороткой к которому он взаимодействовал до 1/2 гомологичного титра(1640). Со специфическими сыворотками к вирусам с подтипами гемагглютининов Н 2-Н 16 получены отрицательные результаты (табл. 1). Ферментативная активность изолята А/красноносый нырок/Балхаш/4523/10 (12) в РИНА подавлялась моноспецифической сывороткой к 2 (табл. 2). С диагностическими сыворотками, содержащими антитела к 1, 3 9 получены отрицательные результаты. Таким образом, выделенный изолят отнесен к вирусу гриппа А с антигенной формулой 1 2. Циркуляция вируса гриппа с подобным подтипом НА среди диких птиц на территории Казахстана не отмечалась в последние 10 лет и его появление в популяциях водоплавающих птиц в регионе совпало с пандемией свиного гриппа 11. Штамм депонирован и хранится в коллекции микроорганизмов РГП на праве хозяйственного ведения НИИ проблем биологической безопасности КН МОН РК (депозитМ-3-13/Д). Изолят А/красноносый нырок/Балхаш/4523/10(12) активно репродуцируется в системе куриных эмбрионов при оптимальной (37 С) температуре до инфекционного титра 6,8 ЭИД 50/0,2 мл. Он обладает высокой гемагглютинирующей(1512) и антигенной активностью (титр иммунной сыворотки в реакции торможения гемагглютинации 11280). Допустимая длительность хранения при -20 С - 2 года. Антигенная структура. Выделенный изолят изучали в РТГА и РИНА с использованием набора референсных сывороток к вирусам гриппа с подтипами НА Н 1-Н 16 и 1-9 (табл. 1, 2). Результаты, представленные в таблицах 1 и 2,показывают,что штамм А/красноносый нырок/Балхаш/4523/10 имеет антигенную формулу 12. Более детальная характеристика вируса дана при определении нуклеотидных последовательностей НА гена методом секвенирования. Результаты сравнительного филогенетического анализа,последовательностей генов этого вируса с таковым штаммов из международного банка данных//////., проведенного с помощью программы 5.1 методом присоединения соседей (модель Тамура-Неи) показали, что казахстанский вирус А/красноносый нырок/Балхаш/4523/10, также как и изоляты А/озерная чайка/Атырау/4378/10 и А/красноносый нырок/Балхаш/4529/10 входят в кластер 1. 1.2,образуемый в основном птичьими вирусами евразийской линии (филограмма). По гену НА казахстанские изоляты 1 формируют монофилетическую группу, ответвляющуюся от штаммов циркулировавших в 2009-11 гг. в Китае и Корее, которые восходят к европейским изолятам пластинчатоклювых 2002-2008 гг., и отдаляются от японских штаммов 2008-2009 гг. Наиболее близким к вирусу А/красноносый нырок/Балхаш/4523/10 был изолят(12) возможно, вариант подобный этому вирусу явился донором НА игенов казахстанских изолятов 12. Из филограммы видно, что гены НА атырауских и балхашских вирусов гриппа 2 филогенетически не связаны с пандемическими штаммами свиного гриппа А/Алматы/347/2009(12),которые представляют отдельную линию генетического кластера Н 1.3. По гену НА изоляты А/озерная чайка/Атырау/4378/10 и А/красноносый нырок/Балхаш/4529/10, выделенные в разных регионах, оказались полностью идентичными между собой и отличались от А/красноносый нырок/Балхаш/4523/2010 лишь на один нуклеотид в результате транзиции , что привело к несинономичной замене кодируемой аминокислоты в положении 39 сна . В отличие от остальных сравниваемых вирусов,НА казахстанского изолята А/красноносый нырок/Балхаш/4523/10(12) отличался уникальными аминокислотными заменами 15, 44, 99. Свойства агглютинации. Исследуемый вирус активно агглютинирует эритроциты курицы,морской свинки, кошки, лошади, барана, крупного рогатого скота и человека 0 группы. Терморезистентность. По термочувствительности НА изолят А/красноносый нырок/Балхаш/4523/10(2) отнесен к термостабильному варианту, поскольку он не терял способности вызывать агглютинацию эритроцитов курицы после прогревания при 56 С в течение 120 мин. Ингибиторочувствителъностъ. Предлагаемый штамм проявляет ингибиторорезистентность по отношению к нативным и прогретым сывороткам курицы, морской свинки, крысы, кролика, барана и лошади. Элюирующая активность. Время элюции вируса А/красноносый нырок/Балхаш/4523/10 (2) с нативных куриных эритроцитов при 37 С составляет 2 ч. К штамму А/красноносый нырок/Балхаш/4523/10(12) получена кроличья иммунная сыворотка с титром в РТГА 11280. Схема иммунизации. Для иммунизации используют кроликов породы Шиншила массой 2,53 кг. Первую иммунизацию проводят подкожно в область шейных и подключичных лимфатических узлов путем 15-20 точечных инъекций концентрированного антигена (100 мкг) в смеси с полным адьювантом Фрейнда ( , ). Через 3 недели животных иммунизируют подкожно(с адьювантом) и внутривенно (без адьюванта) равным количеством антигена. Кровь у животных берут из краевой вены уха через 10 дней после повторной иммунизации. Титр иммунной сыворотки заявляемого штамма в РТГА с гомологичным антигеном составляет 11280. Изолят А/красноносый нырок/Балхаш/4523/10(12) активно репродуцируется в системе куриного эмбриона при оптимальной (37 С) температуре до инфекционного титра 6,8 ЭИД 50/0,2 мл. Он характеризуется высокой гемагглютинирующей(1128) и антигенной активностью (титр иммунной сыворотки в реакции торможения гемагглютинации 11280). Результаты сравнительного филогенетического анализа, указывают на то, что вирус гриппа А/красноносый нырок/Балхаш/4523/10(12) является новым природным изолятом,отличающимся от эталонного штамма А/гусь/Гонконг/8/1976 (12) и других вирусов этого подтипа наличием уникальных аминокислотных замен Аа 15 е, 44,99. Наиболее близким к нему в эволюционном отношении оказался штамм ///02243 06/2011 (12), выделенный от домашних уток в Восточном Китае. Данный факт свидетельствует о возможности переноса отдельных генов вируса гриппа (12) диких водоплавающих в популяцию домашних птиц. Приготовленные на основе оригинального казахстанского штамма диагностические препараты могут быть использованы в вирусологических лабораториях при расшифровке этиологии эпидемических и эпизоотических вспышек гриппа, а также для оценки напряженности популяционного иммунитета у диких и домашних птиц. Таблица 1 Идентификация подтипа гемагглютинина казахстанского изолята вируса гриппа А/красноносый нырок/Балхаш/4523/10 в РТГА Иммунная сыворотка к референсному штамму А/гусь/Гонконг/8/1976 (11) Гомологичный Титр антигемагглютининов к изоляту титр А/красноносый нырок/Балхаш/4523/10 в РТГА 2560 1280 Примечания - даны обратные величины титров специфических антигемагглютининов. С иммунными сыворотками к вирусам гриппа с подтипами гемагглютинина Н 2-Н 15 получены отрицательные результаты Таблица 2 Идентификация подтипа нейраминидазы казахстанского изолята вируса гриппа А/красноносый нырок/Балхаш/4523/10 в РИНА Изолят нырок/Балхаш/4523/10 Примечания -- реакция отрицательная- представлена обратная величина титра ингибирования нейраминидазной активности иммунной сывороткой ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм вируса гриппа А /красноносый нырок/ Балхаш/4523/10, рода А, депонированный в коллекции микроорганизмов РГП на ПХВ Научно исследовательский институт проблем биологической безопасности КН МОН РК за номером М-3-13/Д,используемый для приготовления диагностических препаратов.