Способ получения биомассы дрожжей Candida tropicalis

(51) 12 1/16 (2006.01) 12 1/74 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ разнообразных ферментов и гормонов, улучшающих обмен веществ и усвоение белков и углеводов. Практика убедительно доказала высокую эффективность кормовых дрожжей. Применение их в ряде хозяйств в жидком виде из расчета 10-15 л на голову крупного рогатого скота значительно увеличивает жирность молока (на 0,15-0,2). Применение сухих дрожжей в комбикормах как основного источника витаминов группы В влияет не только на увеличение продуктивности, но и обеспечивает высокую сохранность молодняка. Суть настоящего изобретения заключается в использовании питательной среды, содержащей в качестве источника углерода этанол. Для глубинного выращивания используют одинаковые посевные и ферментационные среды. В качестве посевной и ферментационной среды используют среду следующего состава в (г/л) этанол 90-20 КН 2 РО 4-13,5(4)2 О 4-3,8 42-,0 СаС 126 Н 2 О-0,12 г/л тиамин 0,004 биотин-0,01 дрожжевой автолизат-25,0 мл. Режим культивирования проходит с подпиткой температура - 28 С, скорости вращения мешалки 400 об./мин, аэрация -5 л/мин. С 8 ч роста скорость мешалки 600 об./мин. Подачу подпиточной среды начинают на 16 часов роста со скоростью 20 мл/ч. Состав подпиточной среды г/л этанол 90-533,0 КН 2 РО 4-2,9 (4)2 О 4-5,0 О 4 Н 2 О-3,8 тиамин-0,01 биотин-0,01 дрожжевой автолизат 170,0 мл/л. Культивирование заканчивают к 60 часам роста. Выход сухой биомассы составляет 52 г/л.(72) Раманкулов Ерлан Мирхайдарович Балпанов Дархан Серикович Тен Олег Андреевич Черемисова Татьяна Геннадьевна Барбасова Сауле Кабденовна Михалко Александр Николаевич(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ ДРОЖЖЕЙ(57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, микробиологии, биотехнологии, к производству кормового белка, предназначенного для животноводства. Широкое производство кормовых дрожжей позволяет уменьшить дефицит белка в рационе кормления животных. Биомасса дрожжей является одним из наиболее полноценных в биологическом отношении кормов (около 50 ее сухого вещества составляет белок). В ней содержатся все незаменимые аминокислоты, усваивающиеся лучше,чем белок концентрированных кормов растительного происхождения. Например,в кормовых дрожжах в 9-11 раз больше лизина, в 5-7 метионина, в 2-4 - триптофана, чем в фуражном зерне (ячмень, овес). Дрожжи служат также источником основных витаминов и микроэлементов, 26914 Изобретение относится к микробиологической промышленности, микробиологии, биотехнологии, к производству кормового белка, предназначенного для животноводства. В современном животноводстве большое внимание уделяется обеспечению сбалансированного питания животных. Биомасса дрожжей является одним из наиболее полноценных в биологическом отношении кормов (около 50 ее сухого вещества составляет белок). В качестве штаммов-продуцентов кормового белка используют микроскопические грибы родов, . Особое внимание в последние годы привлекли к себе штаммы дрожжей родаи . Штаммы дрожжей родахорошо растут на углеводородах, синтезируя при этом много белка,липидов и других ценных веществ. В последние годы кормовые дрожжи получают на питательных средах, содержащих углеводороды нефти (очищенные жидкие парафины, в основном С 10-С 20), низшие спирты (этанол и метанол),гидролизаты древесных (опилки, стружка, щепа) и сельскохозяйственных (солома, шелуха семян,кукурузная кочерыжка и т.п.) отходов, сульфитные щелока целлюлозно-бумажного производства,послеспиртовые барды гидролизно- и сульфитноспиртовых производств. Известен способ получения белковых кормовых дрожжей (А.с.906495, 1980), включающий гидролиз сырья растительного происхождения (в т.ч. 25 активного ила) минеральной кислотой при определенной температуре и давлении с последующей биохимической переработкой гидролизатов обычным способом. Недостаток предлагаемого способа заключается в том, что в настоящее время использование активного ила для производства кормовых дрожжей запрещено из-за стоков, состав которых нестабилен и может включать значительные количества вредных примесей, плохо поддающихся контролю и регулированию. Известен также способ получения корма для сельскохозяйственных животных (А.с.1701239,1990), включающий гидролиз древесных отходов серной кислотой и термообработку, с последующей экстракцией сахаров из прогидролизованного сырья с применением последрожжевой бражки. Недостатком данного способа является вторичное использование в технологическом процессе последрожжевой бражки, что увеличивает количество вредных примесей и снижает качество дрожжей, замедляя процесс получения готового продукта. Известен способ культивирования дрожжей для спиртового производства в аэробных условиях на стерильной питательной среде с содержанием сахаров 4-6. В качестве питательной среды используют продукт декантации послеспиртовой барды, сусло или сахарозу. Культивирование ведут до достижения концентрации дрожжевых клеток в культуральной жидкости 500-1000 млн/мл, после чего культуральную жидкость выдерживают в 2 анаэробных условиях в течение 2-3 часов (Патент РФ 2136746, Бюл. 25, 1999 г. Способ культивирования дрожжей для спиртового производства). Недостатком данного способа является невысокая концентрация 500-1000 млн./мл дрожжевых клеток. Ближайшим решением к предлагаемому способу получения биомассы по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения биомассы путем непрерывного выращивания дрожжей родав условиях аэрации на питательной среде, содержащей н-парафин в качестве источника углерода, источники азота,фосфора, минеральные соли и микроэлементы. Культивирование дрожжей проводят непрерывно при рН 4,0-4,2, температуре 32-34 С со скоростью-1 разбавления среды 0,1-0,3 ч . В качестве источника углерода в среду подают парафин и отходы мукомольного производства, например, отруби пшеничные. Это позволяет увеличить выход продукта до 118-240 и снизить расходный коэффициент парафина до 0,42-0,85 г на грамм продукта (Патент РФ 2042713, кл. С 12 Р 21/00, С 12 1/16, С 12 1/26, А 23 1/00, 1995). Недостатком данного способа является сложность подготовки питательной среды, а также необходимость глубокого гидролиза зерноотходов со значительным расходом гидролитических ферментов и использованием лишь осветленной части гидролизата. Задача предлагаемого изобретения заключается в увеличении выхода дрожжевой биомассы на питательной среде, где в качестве источника углерода взят этанол 90 . Технический результат изобретения заключается в увеличении прироста биомассы. Указанный технический результат достигается тем, что культивирование дрожжейшт. СК-4 проходит в режиме с подачей подпитки. Для глубинного выращивания используют одинаковые посевные и ферментационные среды. Наработка посевного материала для ферментации проводят в колбах Эрленмейера с объемом заполнения 100 мл. Состав посевной среды, г/л Этанол 90 - 20,0 КН 2 РО 4 - 13,5(4)2 О 4 - 3,8 42 - ,0 Тиамин - 0,004 Биотин - 0,01 СаС 126 Н 2 О - 0,12 Дрожжевой автолизат-25 мл/л. Проводят засев 3 колб с посевной средой смывом материала с 2 пробирок со скошенным агаром 15 мл стерильной дистиллированной воды. В каждую колбу засевают по 5 мл суспензии. Культивирование посевного материала проводят на термостатируемой качалке при температуре 28 С, скорости вращения 260 об./мин. Продолжительность культивирования 36 ч. Объем полученного посевного материала 500 мл. Этим посевным материалом засевают 7 л ферментера фирмы . Объем среды - 5 л. Состав ферментационной среды, г/л Этанол 90 - 20 КН 2 РО 4 - 13,5(4)2 О 4 - 3,8 42 - ,0 Тиамин - 0,004 Биотин - 0,01 СаС 126 Н 2 О - 0,12 Дрожжевой автолизат-25,0 мл/л. Режим культивирования температура - 28 С,скорость вращения мешалки - 300 об./мин, аэрация 5 л/мин. рН поддерживают раствором аммиака в пределах 4,5-5,0. После 36 часов роста начинают подачу подпитки со скоростью 20 мл/ч. Состав подпиточной среды, г/л Этанол 90 - 520,0 КН 2 РО 4 - 2,9(4)2 О 4 - 5,1 42 - 3,8 Тиамин - 0,01 Биотин - 0,01 Дрожжевой автолизат - 146,0. При ведении процесса культивирования было достигнуто значение сухой биомассы 19,34 г/л. Существенным отличительным признаком предлагаемого способа от прототипа является использование в качестве источника углерода этилового спирта, что позволяет заменить парафин и отходы мукомольного производства на более доступное и стандартизированное сырье и увеличить выход биомассы. Сущность изобретения подтверждается следующими примерами Пример 1 Наработка посевного материала для ферментации осуществлялась в колбах Эрленмейера с объемом заполнения 100 мл. Состав посевной среды, г/л Этанол 90 - 20,0 КН 2 РО 4 - 13,5(4)2 О 4 - 3,8 42 - ,0 Тиамин - 0,004 Биотин - 0,01 СаС 126 Н 2 О - 0,12 Дрожжевой автолизат- 25 мл/л. Провели засев 5 колб с посевной средой смывом материала с 3 пробирок. В каждую колбу засевали по 5 мл суспензии. Культивирование посевного материала осуществляли на термостатируемой качалке при температуре 28 С, скорости вращения 240 об./мин. Продолжительность культивирования 50 ч. Объем полученного посевного материала 500 мл. Проведен засев 7 л ферментера фирмы. Объем среды - 5 л. Состав ферментационной среды, такой же что и у посевной среды. Режим культивирования температура - 28 С,скорость вращения мешалки - 450 об./мин, аэрация 3 л/мин. рН поддерживали раствором аммиака в пределах 4,5-5,0. С 16 часов роста начали подачу подпиточной среды со скоростью 25 мл/ч. Состав подпиточной среды, г/л Этанол 90 - 533,0 КН 2 РО 4 - 2,9(4)2 О 4 - 5,0 42 - 3,8 Тиамин - 0,01 Биотин - 0,01 Дрожжевой автолизат - 170,0. С 21 часа скорость подпитки уменьшили до 20 мл/ч. С 45 часов скорость вращения мешалки увеличили до 1100 об/мин, аэрацию - до 5,5-6,0 л/мин. В ходе процесса была изучена динамика роста биомассы при культивировании на среде с этанолом. При ведении процесса культивирования было достигнуто значение сухой биомассы 48,6 г/л. Пример 2 Наработка посевного материала для ферментации проводилась в колбах Эрленмейера с объемом заполнения 100 мл. Состав посевной среды МД-2, г/л Этанол 90 - 20,0 КН 2 РО 4 - 13,5(4)2 О 4 - 3,8 42 - ,0 Тиамин - 0,004 СаС 126 Н 2 О - 0,12 Биотин - 0,01 Дрожжевой автолизат - 25 мл/л. Проведен засев 5 колб с посевной средой смывом материала с 3 пробирок. В каждую колбу засевалось по 5 мл суспензии. Культивирование посевного материала осуществляли на термостатируемой качалке при температуре 28 С,скорости вращения 240 об./мин. Продолжительность культивирования 72 ч. Материал из колб был слит в аппарат Боброва,объем посевного материала - 500 мл. Проведен засев 10 л ферментера фирмы . Состав ферментационной среды тот же, что и посевной среды МД-2. Объем среды - 5 л. Режим культивирования температура - 28 С, скорость вращения мешалки с 8 часов до 24 часов - 400 об./мин, с 24 часов - 800 об/мин, аэрация - 5 л/мин. С 16 часа роста начали подачу подпиточной среды со скоростью 20 мл/ч. Состав подпиточной среды, г/л Этанол 90 - 533,0 КН 2 РО 4 - 2,9(4)2 О 4 - 5,0 42 - 3,8 Тиамин - 0,01 Биотин - 0,01 Дрожжевой автолизат - 170 мл/л. С 39 часов скорость мешалки увеличили до 1000 об/мин, с 45 часов роста - до 1100 об/мин, скорость подачи подпитки уменьшили до 12 мл/ч. В ходе процесса была изучена динамика роста биомассы при культивировании на среде с этанолом. При ведении процесса культивирования было достигнуто значение сухой биомассы 52 г/л. 3 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения биомассы дрожжей, включающий непрерывное выращивание дрожжей в условиях аэрации на питательной среде,содержащей источники углерода, азота, фосфора, минеральные соли и микроэлементы,отличающийся тем, что используют питательную среду, содержащую в качестве источника углерода этанол в концентрации 90.