Способ определения устойчивости эритроцитов к гипоксии в эксперименте

(51) 01 33/48 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ морфоденситометрическую характеристику,определение следующих параметров в пикселях периметр , площадь , площадь поверхности и деформируемость (/) и при увеличении количества эритроцитов до 6,93 х 1012/л и выше,гемоглобина - до 166,35 г/л и выше, периметра до 31,2 пикселей и выше, площади - до 54,5 пикселей и выше, площади поверхности - до 4735,3 пикселей и выше объема - до 2928,2 пикселей и выше, и снижении деформируемости до 1,62 пикселей и ниже диагностируют нарушение устойчивости эритроцитов к гипоксии. Предлагаемый способ позволяет повысить точность диагностики и ее достоверность, упростить определение, уменьшить затраты времени на его выполнение.(76) Канкожа Мухтар Кожасулы Соколов Александр Дмитриевич Гареев Рауф Ахметович(56) Заявка на изобретение 2007104464/15,2007(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ К ГИПОКСИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ(57) Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной физиологии,лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения устойчивости эритроцитов к гипоксии. Способ определения устойчивости эритроцитов к гипоксии, включает исследование количества эритроцитов, содержания в них гемоглобина и их Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной физиологии,лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения устойчивости эритроцитов к гипоксии. Гипоксия является серьезной проблемой современной медицины, что объясняется высокой частотой этой патологии и тяжелыми последствиями. Так,например,гипоксия,возникающая после операции на легких, вызывает значительные изменения не только в органах грудной полости, но и в других органах и системах организма. Выбор экспериментальной модели был обоснован тем, что в настоящее время отмечается рост числа таких заболеваний легких,сопровождающихся гипоксией, как хронические неспецифические заболевания легких (ХНЗЛ),туберкулез и рак легких, при которых зачастую операция является единственным радикальным и эффективным способом лечения. При этом пульмонэктомия производится в клинической практике чаще, чем обширные двухсторонние резекции легких. Однако, изучение влияния резекции легких на организм в широком плане возможно преимущественно в экспериментальных условиях. Поэтому многие исследователи создавали модель данной патологии и изучали ее на экспериментальных животных, чаще собаках. Известен способ определения скорости внутреннего потребления кислорода эритроцитами,включающий заполнение сосуда из газонепроницаемого материала пробой исследуемой крови полностью, без газовых включений,герметизацию сосуда и размещение его в термостатируемой камере, непрерывное измерение степени насыщенности кислородом исследуемой пробы крови, определение по изменению степени насыщенности крови кислородом скорости ее спонтанной деоксигенации и вычисление скорости внутреннего потребления кислорода эритроцитами. Использование изобретения позволяет с высокой точностью контролировать энергетическое состояние крови и тем самым диагностировать различные гипоксические состояния.(Заявка на изобретение 02146051 С 1,02.27.2000 г. Веретяхин В.В., Зарицкий А.Р.,Переведенцев Е.В. и др.) Недостатком способа является необходимость наличия сложного оборудования для его осуществления - устройства, содержащего сосуд из газонепроницаемого материала для размещения исследуемой пробы крови, термостатируемую камеру, оборудованную приспособлениями для заполнения его кровью полностью, без газовых включений и регистратора с чувствительными элементами. Известен способ определения стабильности клеточных мембран эритроцитов, включающий биохимическое исследование крови и сравнение расчетного показателя с нормой, при этом определяют количество легкоокисляемых фосфолипидов, а о стабильности эритроцитов судят 2 по отклонению от нормы токоферол-показателя,представляющего собой отношение количества токоферола к количеству легкоокисляемых фосфолипидов. Способ позволяет определять способность к адаптации эритроцитов к гипоксии и экстремальным экологическим условиям.(Заявка на изобретение 02234088 С 2,08.10.2004, Авторы Благодатский О.А., Колодяжная Т.А., Терещенко В.П.) Недостатком способа является сложность его осуществления. Известен способ оценки устойчивости эритроцитов к функциональной нагрузке,включающий определение содержания метгемоглобина,мембранно-связанного гемоглобина, окисленных нуклеотидов и суммарной оптической плотности эритроцитов до и после проведения функциональной пробы, в качестве которой используют кратковременную локальную ишемию. Указанные показатели определяют дважды- до и после проведения функциональной пробы. На основании полученных данных вычисляют коэффициент устойчивости эритроцитов к ишемии К. При значении коэффициента К меньше О устойчивость эритроцитов к ишемии оценивают высокой, от О до 0,1 - нормальной, гипоксия эритроцитов определяется при показателе выше 0,1. Изобретение позволяет оценить устойчивость эритроцитов к функциональной нагрузке - тканевой гипоксии. Способ позволяет быстро, качественно и объективно выявить различный характер клеточной адаптации к гипоксии.(Заявка на изобретение 02371723 С 1,10.27.2009 г. Пивоваров Ю.И., Кузнецова Э.Э.,Горохова В.Г. и др.) Однако данный способ также сложен в выполнении, требует анализа большого количества параметров. Известен способ определения устойчивости эритроцитов к гипоксии, для осуществления,которого у обследуемого забирают кровь, в качестве антикоагулянта используют гепарин 0,1 мл. Центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4000 об/мин и получают эритроцитарную взвесь. Проводят измерение действительной части диэлектрической проницаемостиэритроцитарной взвеси сразу после ее получения и через 60 минут на фиксированных частотах - 1 кГц (1) и на 10 кГц (2). Вычисляют коэффициенты поляризации (КП 1 и КП 2) по формуле КП 12. Затем определяют коэффициент устойчивости эритроцитов к гипоксии(КУ). КУКП 2 КП 1 и при его величине 1,0 и меньше диагностируют нарушение устойчивости эритроцитов к гипоксии. Использование изобретения дает возможность динамической оценки эффективности проводимой терапии при заболеваниях, где свободнорадикальные процессы являются ведущими в патогенезе заболевания. Известный способ трудоемкий, для его выполнения требуется много времени и сложных расчетов. Задачей изобретения является разработка более простого и достаточно точного способа диагностики устойчивости эритроцитов к гипоксии. Технический результат - повышение точности диагностики и ее достоверности, упрощение определения, меньшие затраты времени на его выполнение. Указанный технический результат достигается тем, что в способе определения устойчивости эритроцитов к гипоксии, включающем исследование крови, отличительной особенностью, согласно изобретению, является то, что исследуют количество эритроцитов, содержание в них гемоглобина и их морфоденситометрическую характеристику, определяют следующие параметры в пикселях периметр , площадь ,площадь поверхности , объеми деформируемость (/) и при увеличении количества эритроцитов до 6,93 х 1012/ л и выше,гемоглобина - до 166,35 г/л и выше, периметра до 31,2 пикселей и выше, площади - до 54,5 пикселей и выше, площади поверхности - до 4735,3 пикселей и выше объема - до 2928,2 пикселей и выше, и снижении деформируемости до 1,62 пикселей и ниже диагностируют нарушение устойчивости эритроцитов к гипоксии. Способ осуществляется следующим образом. Проводят морфометрическое исследование эритроцитов, для чего готовят тонкий мазок крови на предметном стекле. Затем производят окраску мазка по методике Романовского-Гимзы. Подсчитывают количество эритроцитов и определяют содержание в них гемоглобина. После чего мазок подвергают обработке на аппаратнопрограммном комплексе морфоденситометрии клеток и тканей организма ДиаМорф-,включающем ЭВМ, микроскоп, телевизионный монитор,принтер,телевизионную камеру. Функционально-диагностическое обследование с использованием комплекса осуществляют поэтапно визуализируют изображение объекта с помощью микроскопа при увеличении х 40(происходит отображение изображения на телевизионном мониторе запоминание изображения на персональном компьютере)- выделяют зоны интереса объектов- проводят оценку морфологической структуры выделенных объектов (эритроцитов) анализируют данные,включающие статистическую обработку,информационный анализ Осуществляют вычисление заданных параметров в пикселях. 1.- периметр 2.- площадь 3.- площадь поверхности 4.- объем 5. / - деформируемость. При увеличении количества эритроцитов до 6,93 х 1012/л и выше, гемоглобина - до 166,35 г/л и выше, периметра до 31,2 пикселей и выше, площади - до 54,5 пикселей и выше, площади поверхности - до 4735,3 пикселей и выше объема - до 2928,2 пикселей и выше, и снижении деформируемости до 1,62 пикселей и ниже диагностируют нарушение устойчивости эритроцитов к гипоксии. Для подтверждения эффективности предлагаемого способа диагностики,морфометрические исследования эритроцитов проводили в эксперименте. Для создания экспериментальной модели гипоксии, 34 взрослым собакам обоего пола с массой тела 12-18 кг, была произведена левосторонняя пульмонэктомия общепринятым способом. При этом удалялось 42 всей легочной паренхимы. Экспериментальным животным за 30 минут до начала пульмонэктомии проводили премедикацию введением атропина 0,1 - 0,5 мл, дроперидола 0,25 - 1 мл, димедрола 1 - 2 мл. Базовый наркоз проводили раствором калипсола из расчета 15 мг/кг,либо гексеналом 1 или тиопенталом натрия 2 14 мг/кг массы животного. После релаксации мышц раствором миорелаксина 2 из расчета 0,4 мг/кг массы животного, проводили интубацию для вентиляции легких. Техника оперативного вмешательства При искусственной вентиляции легких производили торакотомию в пятом межреберье заднебоковым доступом. Рефлексогенные зоны корня левого легкого блокировали 0,5 раствором новокаина. Легкое смещали в вентромедиальном направлении. Выделяли основной ствол легочной артерии и пересекали между двумя лигатурами. Левые бронхиальные артерии легировали в области корня удаляемого легкого. Смещением ткани легкого краниально выделяли нижнедолевую вену и пересекали между двумя лигатурами. На центральные отрезки сосудов накладывали прошивные лигатуры. При смещении легкого каудально выделяли и легировали вены верхней и средней доли. На рассеченный бронх накладывали шов. После проверки на герметичность наложенных швов и лигатур рану грудной стенки ушивали наглухо. Забор крови производили перед выведением животных из опыта и готовили тонкий мазок крови на предметном стекле, который окрашивали по методике Романовского-Гимзы. Морфоденситометрический анализ проводили на аппаратно-программном комплексе для морфоденситометрии клеток и тканей организма ДиаМорф -. При морфометрическом исследовании эритроцитов выяснилось, что по сравнению с контролем на фоне гипоксии достоверно увеличилось количество эритроцитов на 18,4,гемоглобина на 9,23 и морфоденситометрические показатели эритроцитов Показатели Виды животных Собаки Гипоксия 1,620,04 Примечание - Р 0,5 - Р 0,01- Р 0,001 по сравнению с контролем Таким образом, в эксперименте получены достоверные данные об изменении параметров,описывающих морфоденситометрический профиль эритроцита. Увеличение количества эритроцитов и содержания в них гемоглобина, наличие отклонений от правильной формы и среднего размера, т.е. появление в совокупности изменений их периметра,площади, площади поверхности, объема и деформируемости указывает на нарушение метаболических процессов в этих клетках крови и в целом на развитие недостаточности кислорода в организме и нарушение устойчивости к гипоксии. Это дат возможность использовать предлагаемый способ для определения нарушения устойчивости эритроцитов к гипоксии в раннем периоде патологических состояний с целью своевременной их коррекции. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ определения устойчивости эритроцитов к гипоксии в эксперименте, включающий исследование крови, отличающийся тем, что исследуют количество эритроцитов, содержание в них гемоглобина и их морфоденситометрическую характеристику, определяют в пикселях такие параметры как периметр , площадь ,площадь поверхности , объеми деформируемость (/) и, при увеличении количества эритроцитов до 6,93 х 1012/л и выше,гемоглобина до 166,35 г/л и выше, периметра до 31,2 пикселей и выше, площади до 54,5 пикселей и выше, площади поверхности до 4735,3 пикселей и выше, объема до 2928,2 пикселей и выше, а также снижении деформируемости до 1,62 пикселей и ниже диагностируют нарушение устойчивости эритроцитов к гипоксии.