Способ иммуно-гормональной диагностики крупного плода

КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ особенностей иммунорегуляторной действия соматотропного гормона в условияхв третьем триместре беременности, заключающийся в определении изменений характера действия экзогенного соматотропного гормона на процесс розеткообразования Т-лимфоцитов периферической крови беременных с эритроцитами барана. Для макросомии в третьем триместре в отличие от нормосомии характерно достоверное увеличение частоты стимулирующего эффекта на экспрессию рецепторов к эритроцитам барана на Т-лимфоцитах,что определяется по изменению относительного количества определяемых розеткообразующих клеток после их инкубации при 37 С в течении 60 минут с экзогенным соматотропным гормоном при концентрации 6,0 мкЕД/мл.(72) Цой Игорь ГиленовичТастанбекова Шолпан Оразхановна(56) Кравец Е.Б., Посевкина В.Н., Казанцева Н.В. Клинико-метаболический статус плода и новорожденного при рождении с крупной массой тела// Педиатрия, 1992,1, с.18-21(57) Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и лабораторной диагностике,предназначено для ранней диагностики крупного плода (макросомии). Способ основан на изучении 22541 Изобретение относится к медицине, а именно акушерской патологии, предназначено для ранней диагностики крупного плода. Известным способом иммунологической и гормональной диагностики крупного плода(макросомии) является определение в сыворотке крови матери динамики уровней инсулина,соматотропного гормона (СТГ) и циркулирующих иммунных комплексов (Кравец Е.Б., Посевкина В.Н., Казанцева Н.В. Клинико-метаболический статус плода и новорожденного при рождении с крупной массой тела // Педиатрия, 1992.-1.- с.1821). Сущность настоящего способа диагностики заключается в установлении исходно высокого уровня в сыворотке крови инсулина в начале с последующим снижением к концу беременности,обратной динамики концентрации соматотропного гормона при постоянно высоких значениях циркулирующих иммунных комплексов. Основными недостатками данного способа диагностики являются следующие моменты. Во-первых, он не предусматривает определение состояния клеточного звена иммунологической реактивности организма беременных, особенно Тлимфоцитов, играющих важную патогенетическую роль в формировании макросомии плода. Во-вторых, в данном способе не учитывается такой важный момент, как характер иммуногормональных взаимоотношений, имеющих, как правило,большее диагностическое и прогностическое значение при многих видах патологии, нежели изолированное определение иммунологических и гормональных показателей. В третьих,показатели нормы,как иммунологических,так и гормональных показателей носят относительный характер, а отклонения от контрольных величин также строго индивидуализированы, что зачастую осложняет определение либо повышение, либо снижение конкретного параметра. Четвертое,повышение циркулирующих иммунных комплексов имеет место при целом ряде заболеваний и патологических состояний и не является строго специфичным для развития макросомии признаком. Задача изобретения - способ диагностики крупного плода (макросомии) в третьем триместре беременности,основанный на определении характера иммуно-гормональных взаимоотношений,специфичных для макросомии, и заключающихся в определении характера действия экзогенного соматотропного гормона на экспрессию рецепторов к эритроцитам барана на мембранах Т-лимфоцит в периферической крови беременных женщин в условиях. Настоящий способ разработан с учетом важной патогенетической роли Г и нарушений Тклеточного звена иммунной системы в формировании макросомии, а также известной иммунорегуляторной функции настоящего гормона,которая в условиях патологии может существенно отличаться от нормы. 2 Сущность способа заключается в изучении характера действия экзогенного соматотропного гормона на состояние экспрессии рецепторов к эритроцитам барана (Е-рецепторы) Т-лимфоцитов периферической крови беременных в третьем триместре беременности в нагрузочном тесте активного розеткообразования. Степень экспрессии Е-рецепторов определяется по количеству лимфоцитов, формирующих розетки с нативными эритроцитами барана (прикрепляющих к своей поверхности более трех эритроцитов), и отражает функциональную активность Тлимфоцитов. При риске развития крупного плода экзогенный соматотропный гормон при кратковременном инкубировании с лимфоцитами периферической крови беременных в 65,0 усиливал, а в 15,0 снижал экспрессию на Т-лимфоцитах рецепторов к эритроцитам барана, что проявляется в увеличении или снижении количества определяемых Тлимфоцитов, формирующих розетки с эритроцитами барана. По сравнению с беременными женщинами с нормальным весом плода частота стимулирующего эффекта экзогенного СТГ достоверно повышается, а ингибирующего, наоборот, снижается. Способ осуществляется следующим образом. Лимфоциты (мононуклеары) выделяются из гепаринизированной венозной крови общепринятым методом седиментации центрифугированием (400,45 минут) в градиенте плотности фиколлверографина или только верографина с удельной плотностью 1,077 г/см 3. После двукратного отмывания центрифугированием при 1,5 тыс. об/мин в среде 199 10 минут, разводят до рабочей концентрации 2 х 106/мл. Опытная проба лимфоцитов инкубируется в течение 60 мин при 37 С в присутствии экзогенного соматотропного гормона в концентрации 6,0 мкЕД/мл. Контрольная проба инкубируется только в питательной среде. По окончанию часовой инкубации клетки обеих проб отмывают центрифугированием, к 200 мкл взвеси мононуклеарных клеток добавляют 2-нуго взвесь нативных эритроцитов барана в среде 199,центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин и инкубируют 15 минут при 4 С. По окончанию инкубации в нативных мазках в раздавленной капле в световом микроскопе подсчитывают относительное количество так называемых активных Е-розеткообразующих лимфоцитов(клетки, фиксировавшие на своей поверхности 3 и более эритроцитов барана). Эффект экзогенного соматотропного гормона оценивали в случае увеличения или уменьшения относительного количества определяемых розеток в опытных пробах, в сравнении с контрольными, не менее чем на 5,0, что находится в пределах технических погрешностей визуальной оценки результатов розеточного теста. Пример 1. С использованием данного способа было обследовано 40 беременных женщин, в последующим родивших крупных новорожденных 22541 нормальным - весом). Обследование было выполнено в третьем триместре беременности. Полученные результаты приведены в таблице 1. Таблица 1 Частота эффектов СТГ на экспрессию Е-рецепторов Т-лимфоцитов периферической крови при макро- и нормосомии Обследованные группы Макросомия (40) Нормосомия ( 20) Р Частота направленности эффекта на экспрессию Е-рецепторовповышение снижение без эффекта 65,07,5 15,05,6 20,06,3 25,09,7 45,011,1 30,010,2 0,05 0,05 0,05 Из приведенных в таблице 1 данных видно, что в случаях рождения макросомов экзогенный СТГ оказывал выраженный стимулирующий эффект на экспрессию Е-рецепторов на Т-лимфоцитах периферической крови, частота которого в 2,6 раза превышала аналогичный эффект при нормальном весе плода (65,07,5 и 25,09,7, р 0,05). Кроме того, при макросомии в 3,0 раза реже обработка лимфоцитов экзогенным СТГ приводила к снижению экспрессии Е-рецепторов на циркулирующих Т-клетках(15,05,6 и 45,011,19), чем при нормальном плоде. Таким образом, характерными признаками при макросомии являются высокая частота стимуляции экзогенным СТГ экспрессии Е-рецепторов на Тлимфоцитах периферической крови и меньшая ингибирования, по сравнению с нормосомией. Пример 2. Для сравнения чувствительности предлагаемого способа и приведенного близкого аналога были выполнены сопоставительные исследования на 23 женщинами с крупным плодом и 21 - с нормальным. Полученные данные приведены в таблице 2. Таблица 2 Сравнительное сопоставление чувствительности предлагаемого способа и прототипа при диагностике крупного плода в третьем триместре беременности (частота положительных результатов) Группы (по величине плода) Макросомия Предложенный способ Стимуляция Ингибиция Е-РОК СТГ Е-РОК СТГ 18 3 Примечание абсолютные цифры, в скобках частота в процентах. В качестве объекта исследования в аналоге была использована сыворотка крови, в которой уровни гормонов(инсулина и СТГ) определяли стандартным твердофазным методом иммуноферментного анализа(ИФА) с использованием тест-систем Вектор-Бест (г. Новосибирск, Российская Федерация). Уровни циркулирующих иммунных комплексов оценивали с помощью традиционной реакции их преципитации ПЭГ-6000 с последующим фотометрированием плотности осадков на спекторофотометре. Из приведенных в таблице 2 данных видно, что по результатам предлагаемого способа стимулирующий эффект СТГ на активное Ерозеткообразование регистрировался достоверно чаще при крупном, чем и при нормальном по весу плоде. Так, частота положительных результатов в соответствующих группах равнялась 78,38,6 и 33,310,3 случаев (р 0,05). Несмотря на отсутствие статистически значимых отличий в частоте ингибирующего эффекта гормона на экспрессию Е-рецепторов на Т-лимфоцитах при Прототип Высокий СТГ 14 Высокий уровень ЦИК 19 макро- и нормосомии, что, прежде всего, связано с относительно небольшим числом наблюдений, такая направленность эффекта у беременных с макросомией отмечалась в 3,7 раза реже, чем при нормосомии(13,07,0 и 47,610,9 соответственно). По результатам близкого аналога ни по одному из трех показателей нам не удалось установить статистически значимые отличия между сопоставляемыми группами беременных, хотя частота признака в случае макросомии и была выше,чем при нормальном плоде. Следовательно,предлагаемый способ диагностики макросомии, основанный на оценке характера иммуно-гормональных взаимоотношений,при небольшой выборке был достоверно точнее близкого аналога, основанного на изолированном определении в сыворотках крови гормонов инсулина и СТГ, а также циркулирующих иммунных комплексов. Пример 3. Поскольку в первых двух примерах нами не было установлено статистически значимых отличий по частоте ингибирующего эффекта экзогенного СТГ на экспрессию Е-рецепторов Т 3 22541 лимфоцитов периферической крови у беременных с макросомией и нормосомией, что, скорее всего,связано с относительно небольшим числом обследованных, нами было проведено объединение результатов, полученных в обоих примерах. Соответствующие результаты приводятся в таблице 3. Из приведенных в таблице 3 данных видно, что в случае объединения результатов первого и второго примеров, удается установить статистически значимое отличие по частоте ингибирующего эффекта экзогенного СТГ на экспрессию мембранных рецепторов к эритроцитам барана на Тлимфоцитах периферической крови беременных с крупных и нормальным плодом 14,34,4 и 46,37,8 соответственно. Полученные данные свидетельствуют о том, что в целом повышение экспрессии Е-рецепторов на Тлимфоцитах периферической крови под воздействием СТГ у беременных женщин с крупным плодом является специфическим признаком, что проявляется также в достоверном снижении частоты характерного для нормосомии ингибирующего действия кратковременной инкубации лимфоцитов с экзогенным СТГ на способность Т-лимфоцитов формировать активные розетки с нативными эритроцитами барана. Таблица 3 Частота эффектов СТГ на экспрессию Е-рецепторов Т-лимфоцитов периферической крови при макросомии при объединении результатов из примера 1 и примера 2. Обследованные группы Макросомия (63) Нормосомия (41) Р Частота направленности эффекта на экспрессию Е-рецепторовповышение Снижение без эффекта 44 (69,85,8) 9 (14,34,4) 10 (15,94,6) 12 (29,37,1) 19 (46,37,8) 10 (24,46,7) 0,05 0,05 0,05 Таким образом, предлагаемый метод отражает имеющие место изменения в характере иммуногормональных взаимоотношений, в частности между соматотропным гормоном и Т-лимфоцитами,при развитии макросомии. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ иммуно-гормональной диагностики крупного плода, включающий исследование крови, отличающийся тем, что кровь исследуют в третьем триместре, выделяют лимфоциты, подсчитывают число розеткообразующих Т-лимфоцитов до и после их инкубации при 37 С в течение 60 минут с соматотропным гормоном в концентрации 6,0 мкЕД/мл и при увеличении числа розеткообразующих Т-лимфоцитов после инкубации относительно данных до инкубации,диагностируют крупный плод.