Штамм ротавируса крупного рогатого скота алматы /96/ av – № 0041 казниви, используемый для изготовления вакцинных и диагностических препаратов

(51) 12 7/00 (2009.01) 61 39/15 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении штамма ротавируса крупного рогатого скота,культивирование которого обеспечивает получение культуральной массы ротавируса крупного рогатого скота с высокой биологической активностью,обеспечивающую достаточные антигенные свойства при изготовлении вакцинных и диагностических препаратов. Штамм ротавируса крупного рогатого скота Алматы /96/ -0041 - КазНИВИ, семейства, роду(Лаборатория по изучению генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью КазНИВИ), используемый для диагностики и профилактики ротавирусной инфекции крупного рогатого скота. Указанный штамм ротавируса круного рогатого скота депонирован в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов КазНИВИ.(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(56) Асташенко Н.Ж. Антигенные свойства ротавируса крупного рогатого скота. Бюллетень ВИЭВ, 1983. Вып. 52, с. 3-5(54) ШТАММ РОТАВИРУСА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА АЛМАТЫ /96/-0041 КАЗНИВИ,ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИННЫХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ(57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики и диагностики ротавирусной инфекции крупного рогатого скота. 22514 Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики и диагностики ротавирусной инфекции крупного рогатого скота. Известен штамм ротавируса, используемый для изготовления вакцины против ротавирусной инфекции крупного рогатого скота (Асташенко Н.Ж. Антигенные свойства ротавируса крупного рогатого скота. Бюллетень ВИЭВ, 1983. Вып. 52, с.3-5) Недостатком указанного штамма является то, что его антигенные свойства не соответствуют антигенным свойствам эпизоотических штаммов,циркулирующих в Республике Казахстан. Задачей изобретения является получение штамма ротавируса крупного рогатого скота антигенные свойства которых соответствуют эпизоотическим штаммам региона,обладающего широким антигенным спектром. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении штамма ротавируса крупного рогатого скота,культивирование которого обеспечивает получение культуральной массы ротавируса крупного рогатого скота с высокой биологической активностью,обеспечивающую достаточные антигенные свойства при изготовлении вакцинных и диагностических препаратов. Штамм ротавируса крупного рогатого скота Алматы /96/0041 - КазНИВИ, используемый для накопления вируссодержащего материала,необходимого в изготовлении диагностических и вакцинных препаратов,репродуцируется в культурах клеток с высокой биологической активностью. Штамм ротавируса крупного рогатого скота используют для получения биомассы ротавируса путем его репродукции в перевиваемых линиях клеток почки бычка, почки свиньи, почки кролика. Указанный штамм ротавируса круного рогатого скота депонирован в лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов КазНИВИ. Штамм ротавируса крупного рогатого скота Алматы /96/0041 - КазНИВИ. Штамм получен из эпизоотического изолята ротавируса крупного рогатого скота путем длительного серийного пассирования с целью ослабления патогенности и стабилизации биологических свойств с помощью перемежающихся пассажей в перевиваемых линиях клеток , РК - 15,- 13 и в организме телят. Полученный штамм характеризуется следующим признаками Назначение штамма штамм Алматы /96/0041- КазНИВИ ротавируса крупного рогатого скота патогенен по отношению к новорожденным телятам, обладает активной репродуктивной способностью в организме кроликов, мышей, в культуре клеток перевиваемых линий и накапливается в желудочно-кишечном тракте восприимчивых и лабораторных животных в концентрации 106,0 ЛД 50/г, в культуре клеток - в 2 титре 105,0 - 105,5 ТЦД 50/см 3, позволяющих готовить диагностические и вакцинные препараты. Состав среды и условия культивирования для репродукции ротавируса крупного рогатого скота и получения вирусного материала используют перевиваемые линии клеток(почки бычка),РК - 15 (почки свиньи),- 13 (почки кролика). Культуры клеток выращивают в питательных средах 199, Игла БМЕ, Иглас добавлением 5 фетальной сыворотки крови овец или 10 сыворотки крови крупного рогатого скота,инкубируют в термостате при 37 С 5-7 сут. Морфологические признаки. Ротавирус крупного рогатого скота относится к семейству ,родубезоболочечный вирус (не имеющий липопротеидную мембрану), имеющий РНК и 3 молекулы белка в сердцевине,группоспецифический антигенный белок во внутреннем капсиде,типоспецифические антигенные 2 белка в наружном капсиде, размер вирионов вируса в пределах 55-66 нм. Штамм Алматы /96/0041 - КазНИВИ ротавируса крупного рогатого скота обладает морфологическими признаками, свойственными для возбудителя ротавирусной инфекции крупного рогатого скота родасемейства . Культуральные свойства. Для репродукции и получения биомассы вируса образцы возбудителя ротавирусной инфекции крупного рогатого скота(титр 5,0-5,5 ТЦД 50/см 3) вводят на монослой культур клеток из расчета 110 в каждый флакон,предварительно выливают ростовую среду и промывают монослой клеток 2-3 раза раствором Хенкса. Для увеличения инфекционности ротавируса в вируссодержащую суспензию вливают 0,25 раствор трипсина из расчета 5,0 мг/мл. Вирусный материал, содержащий раствор трипсина, оставляют в контакте с клетками 1,0-1,5 ч при комнатной температуре (в течение которого ротавирус получает возможность адсорбироваться и проникнуть в клетку), затем сливают содержимое флакона и наливают поддерживающую среду без сыворотки. В контрольных флаконах ростовую среду заменяют на поддерживающую. Все флаконы ставят в термостат при 37 С и ежедневно просматривают их под микроскопом (об.10 х, ок. 7 х) для установления цитопатогенного действия (ЦПД) ротавируса на культуры клеток. Цитопатический эффект проявляется через 48-72 ч после заражения и характеризуется появлением пустот-окон между клетками. На 3 сут эти окна мелкие, затем они постепенно увеличиваются в размерах и появляются серповидные клетки с растянутой цитоплазмой. К 57 суткам поражается более 80 клеточного монослоя, при этом ротавирус накапливается в титрах 105,0 - 105,5 ТЦД 50/см 3. После отбора пробы для определения биологической активности,рН вирусного материала доводят до 7,2-7,4 и замораживают при - 20 С. Затем вирусный материал трехкратно размораживают-замораживают, после чего осветляют и концентрируют. 22514 Концентрированный вирусный материал титруют (106 - 108 ТЦД 50/см 3), инактивируют. Антигенные свойства. Штамм Алматы /96/0041 - КазНИВИ ротавируса крупного рогатого скота с титром 106 - 108 ТЦД 50/см 3 в инактивированном виде в организме глубокостельных коров при подкожном и внутримышечном введении в дозе (7) 5 мл стимулирует образование преципитирующих (РДП) и вируснейтрализующих (РН) антител. У всех обследованных животных в сыворотке крови в РДП до вакцинации антитела к ротавирусу не выявлены. Опытных животных разделили на 2 группы по 10 голов в каждой. Стельных коров контрольной группы не вакцинировали. Глубокостельных коров опытной группы вакцинировали ротавирусным антигеном в дозе 5 мл внутримышечно в область крупа за 30 и 15 дней до отела. Через 2 недели после первой вакцинации титр антител в РДП был равен 116, в РН - 132. Через 2 недели после второй вакцинации в дни отелов в сыворотке крови выявлено наибольшее количество антител, титр которых в РДП достигал 132, в РН 164, в молозиве - 1128, тогда как у животных опытной группы антитела не обнаруживались. Патогенные свойства. Штамм Алматы /96/0041 - КазНИВИ ротавируса крупного рогатого скота патогенен по отношению новорожденных телят восприимчивых по отношению к данному антигенному варианту ротавируса. Инфекция клинически проявляется в виде энтерита и рецидивирующей диареи. Патогенность проявляется через 24-36 ч после инфицирования депрессией,потерей аппетита,диареей,повышением температуры тела до 41 С. На инфицированных культурах клеток ЦПД штамма проявляется через 36-48 ч, к 72-96 ч цитопатический эффект усиливается увеличением пустот - окон в монослое клеточного пласта,появлением серповидных клеток. У зараженных лабораторных животных патогенность штамма проявляется повышением температуры тела, рецидивирующей диареей,обезвоживанием организма и к 72-96 ч гибелью животных. Иммуногенные свойства. Штамм Алматы /96/0041 - КазНИВИ ротавируса крупного рогатого скота,репродуцированный в организме новорожденных телят, вызывает заболевание телят. У выздоровевших телят и у иммунизированных инактивированным вирусом в дозе (7)5 мл с титром биологической активности 106-108 ТЦД 50/см 3. У стельных коров формируется иммунитет, который у телят защищает от повторных введений вирулентного возбудителя ротавируса, у стельных коров специфические противоротавирусные антитела накапливаются в молочной железе и после отела с молозивом и молоком колостральный иммунитет передается новорожденным телятам и защищает их от ротавирусной инфекции. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма Алматы рогатого скота при культивировании в культуре клеток , -15, -13 сохраняются в течение 10 последовательных пассажей (срок наблюдения). Сохраняемость. Штамм Алматы /96/0041 КазНИВИ ротавируса крупного рогатого скота в культуральной вируссодержащей суспензии не снижает своей активности в течение 15 сут при температуре 4 С, 6 мес - при - 20 С, 3 года - при 40 С и - 70 С. Пример 1. Для приготовления инактивированной вакцины штамм Алматы /96/0041 - КазНИВИ ротавируса крупного рогатого скота репродуцируют в культуре клеток перевиваемых линий , 15, -13, культивируемых в питательных средах 199, Игла БМЕ, Иглас добавлением 5 фетальной сыворотки крови овец или 10 сыворотки крови крупного рогатого скота в термостате при 37 С. Из флаконов с формировавшимся монослоем клеток, сливают ростовую среду и промывают 2-3 раза раствором Хенкса. Затем заливают вирус с биологической активностью 5,0-5,5 ТЦД 50/см 3 в соотношении 110 к объему культурального сосуда. Для увеличения инфекционности ротавируса в вируссодержащую суспензию вливают 0,25 раствор трипсина из расчета 5,0 мг/мл. Вирусный материал, содержащий раствор трипсина, оставляют в контакте с монослоем клеток 1,0-1,5 ч при комнатной температуре. В течение этого времени вирус адсорбируется на разрыхленную трипсином поверхность клеточного пласта и получает возможность проникнуть в клетки. По истечению времени вируссодержащую смесь сливают и во флакон наливают поддерживающую среду без сыворотки. В контрольных флаконах ростовую среду заменяют на поддерживающую. Все флаконы ставят в термостат при 37 С и ежедневно просматривают их под микроскопом (об 10 х, ок 7 х) для установления цитопатогенного действия (ЦПД) ротавируса на культуры клеток. Смену среды проводят однократно через 48 час. Цитопатический эффект проявляется через 48-72 ч после заражения и характеризуется разрыхлением монослоя клеточного пласта,появлнием пустот в монослое - окон между клетками. На 2-3 сутки эти окна мелкие, затем они постепенно увеличиваются в размерах и на 5-6 сут появляются клетки с серповидной формой цитоплазмы. К 6-7 суткам поражается более 80 клеточного монослоя,при этом остаток разрушенного монослоя со стенок флаконов снимают встряхиванием и флаконы замораживают при - 20 С. Накопленную таким образом вируссодержащую суспензию оттаивают при комнатной температуре,устанавливают рН 7,2-7,4 и замораживают и оттаивают трижды, после чего осветляют и концентрируют. Концентрированный вирусный материал титруют, инактивируют, смешивают с адъювантом в соотношении 14. Из накопленной вирусной суспензии обирают пробы для определения стерильности и 3 22514 биологической активности. Испытания на стерильность проводят по ГОСТ 28085 биологическую активность определяют на пробирочных культурах клеток, которая равнялся 5,0-5,5 ТЦД 50/см 3. Для получения биологически активного антигена проводят осветление вирусного материала центрифугированием и концентрирование дифференциальным ультрацентрифугированием,после чего определяют биологическую активность вируса, который равнялся 8 ТЦД 50/см 3. Вирусную биомассу инактивируют глутаральдегидом до конечной концентрации 0,02 при рН 7,4, выдерживают при температуре 37 С в течение 24 ч, периодически перемешивают каждые 3 ч по 5 мин. Полученный антиген сорбируют 3 -ным гелем ГОА до конечной концентрации 1 , выдерживают при 4 С 24 ч, после чего вакцину расфасовывают и проводят контроль иммунобиологических свойств. Полученную таким образом инактивированную вирусную суспензию розового цвета, с выпадающим осадком при длительном хранении, используют в качестве инактивированной вакцины для активной иммунизации глубоко - стельных коров с тем, чтобы колостральный иммунитет передавался новорожденным телятам. Коров иммунизируют внутримышечной инъекцией вакцины двукратно в дозе 5 см 3. Для проверки иммуногенности испытуемого биопрепарата 4 телят, рожденных от иммунных коров матерей подвергают контрольному заражению вирулентным вирусом в дозе 105 ЛД 50/см 3 на 12 сутки после вакцинации. Таким же образом заражают вирусом 2 телят рожденных от неиммунных коров - матерей. За опытными и контрольными животными наблюдают в течение 14 сут., в течение которых все опытные телята остаются здоровыми, а телята контрольной группы заболевают в результате репродукции вируса в ЖКТ, проявляющейся в виде энтерита и рецидивирующей диареи. Пример 2. Для приготовления ротавирусного антительного эритроцитарного диагностикума штамм Алматы /96/0041 - КазНИВИ ротавируса,- 13. Полученную вируссодержащую суспензию осветляют центрифугированием при 2000 об/мин и концентрируют ультрацентрифугированием при 15000 и 30000 об/мин. Концентрированным ротавирусным антигеном иммунизируют кроликов весом 3 кг в область подколенных лимфоузлов двукратно 0,2 мл антигена в смеси с 0,2 мл полного адъюванта Фрейнда, подогретого до 37 С. Интервал между иммунизациями 20 дней, послеиммунизации через 10 дней кроликов тотально обескровливают, получают от 2 кроликов 2 л крови,из которой отделяют сыворотку в количестве 1,2 л. Сыворотку в асептических условиях замораживают и хранят в морозильной камере при - 20 С. Гипериммунную кроличью сыворотку, взвесь формалинизированных эритроцитов,раствор амидола используют в качестве антительного эритроцитарного диагностикума для выявления ротавирусного антигена в патологическом материале в реакции пассивной гемагглютинации(РПГА). В качестве сенситина используют нормальную кроличью сыворотку. Полученный таким образом антительный эритроцитарный диагностикум испытывают на специфичность и диагностическую активность в РПГА с биоматериалом, содержащим ротавирус крупного рогатого скота штамм Алматы /96/. Результаты исследований показали,что использованные сенсибилизированные эритроциты агглютинируются при смешивании с биоматериалом, содержащим ротавирус крупного рогатого скота, титр которого был равен 1512. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм ротавируса крупного рогатого скота Алматы /96/-0041- КазНИВИ (Лаборатория по изучению генофонда микроорганизмов ТОО КазНИВИ), используемый для изготовления вакцинных и диагностических препаратов.