Способ приготовления противочумной вакцины

(51) 61 39/187 (2009.01) 12 7/00 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ изготовления биопрепарата, пригодного для профилактики чумы человека и животных. Достигаемый результат - повышение качества вакцины, расширение арсенала средств против чумы, снижение расходов пищевого материала за счет использования не употребляемых в пищу животных и упрощение способа. Для этого в способе приготовления противочумной вакцины,включающем культивирование вируса в организме животных с последующим получением зараженного вирусного материала, согласно изобретению, культивируют вирус штаммаи проводят анимализацию вакцинного штамма путем пассажа через организм морских свинок, а в качестве вирусного материала используют ткань из места введения вирусного препарата, регионарные лимфатические узлы и селезенку инфицированных морских свинок.(72) Айманова Ольга Яковлевна Мельникова Нина Николаевна Пономарева Татьяна Сергеевна Тугамбаев Тлеули Идрисович Айкимбаев Алим Масгутович Силина Елена Николаевна Рябушко Елена Александровна(73) Республиканское государственное казенное предприятие Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций имени Масгута Айкимбаева Министерства здравоохранения Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРОТИВОЧУМНОЙ ВАКЦИНЫ(57) Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для 22420 Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для изготовления биопрепарата, пригодного для профилактики чумы человека и животных. Известен способ приготовления противочумной вакцины, при котором из почек 1-2 месячных ягнят готовят первично-трипсинизированную культуру клеток по общепринятой методике, и рассеивают в культуральные сосуды в полуторалитровые сосуды-(18020) см 3, в пробирки - от 1,0 до 1,5 см 3 с концентрацией (15020) тысяч клеток на 1 см 3 и в трехлитровые круговые сосуды - (30030) см 3 с концентрацией (60050) тысяч клеток на 1 см 3. Трехлитровые сосуды культивируют в роллерных аппаратах со скоростью вращения от 10 до 12 об/мин,остальные культуральные сосуды инкубируют в стационарном положении, пробирки в специальных кюветах под углом 5. При сформировании полного монослоя (на 2-4 сут.) из сосудов удаляют ростовую среду, клетки заражают разбавленной поддерживающей средой в соотношении 1100 вирусом,внося в полуторалитровые сосуды 200 см 3 среды, а в роллерные сосуды -по 300 см 3 (доза заражения 0,010,02 ТЦД на клетку). Зараженные клетки инкубируют при температуре 37,00,5 С со сменой поддерживающей среды через каждые 2-3 дня. При поражении 70-90 клеточного пласта сосуды замораживают при температуре минус 401 С в течение 18-20 часов. Размораживание проводят при температуре 202 С, содержимое сосудов объединяют в одну емкость, берут пробы для определения биологической активности и стерильности. Вируссодержащую суспензию объединяют с защитной средой (содержащей пептона 5 и сахарозы 3 ) в соотношении 11, добавляют пенициллин 100000 ЕД, стрептомицин 0,1 г и нистатин 25000 ЕД на 1 дм 3 смеси. Разливают в ампулы и сушат сублимационным методом. Перед загрузкой этажерку морозильной и сублимационной камеры обрабатывают грубодисперсным аэрозолем 70 спирта-ректификата (из расчета 50 см 3 на 1 м 2) с последующей обработкой УФ-лучами в течение 30 мин (предварительный патент РК 16916. кл. А 61 К 39/12,2006). Добавка пенициллина,стрептомицина и нистатина усложняет состав вакцины и ограничивает возможность ее применения, так как пенициллин и стрептомицин являются сильными аллергенами и могут вызвать анафилактический шок. Известен способ получения противочумной вакцины, который заключается в использовании животных (коз) в качестве доноров и включает приготовление органотканевой суспензии из лимфатических узлов и селезенки инфицированных коз, инактивации суспензии 1,5-5,0 хлороформом и использовании его в качестве вакцинного препарата ( ., 1981, 39, 25-28). Недостаток указанного способа заключаются в том, что для получения вакцины используют органы искусственно инфицированных крупных животных 2 коз, что очень дорого, зачастую недоступно, а объем полученного материала ограничен. При этом инфицированные туши коз подлежат уничтожению,что приводит к неоправданным расходам ценного пищевого материала. Использование хлороформа снижает качество вакцины и создает дополнительные трудности за счет образования реакций в местах введения вакцины и общего состояния животных. Задачей изобретения является усовершенствование способа получения противочумной вакцины,характеризующейся высокой приживаемостью в организме человека. Достигаемый результат - повышение качества вакцины, расширение арсенала средств против чумы, снижение расходов пищевого материала за счет использования не употребляемых в пищу животных и упрощение способа. Для этого в способе приготовления противочумной вакцины,включающем культивирование вируса в организме животных с последующим получением зараженного вирусного материала, согласно изобретению, культивируют вирус штаммаи проводят анимализацию вакцинного штамма путем пассажа через организм морских свинок, а в качестве вирусного материала используют ткань из места введения вирусного препарата, регионарные лимфатические узлы и селезенку инфицированных морских свинок. Способ осуществляют следующим образом. Для приготовления противочумной вакцины используют производственную культуру штамма, которая должна находиться в -форме, обладать морфологическими,культуральными и биохимическими свойствами океанической(глицеринонегативной) разновидности чумного микроба и стойко удерживать свой биохимический тип. Морфологию колоний изучают на агаре Хоттингера, рН (7,10,1). Морфологию микробов производственной культуры проверяют микроскопией мазков,приготовленных из двухсуточной агаровой и бульонной культур, выросших при температуре(271) С и (371) С и окрашенных по Граму и Гинсу (для выявления капсул). Биохимические свойства определяют при выращивании микробов производственной культуры в (50,5) мл пептонной воды с 1 глицерина, 1 сахарозы, 1 лактозы, 1 рамнозы и индикатором Андреде. Штаммдолжен лизироваться бактериофагами диагностическими чумными Л-413 С и Покровской. На газоне культуры в чашке Петри, засеянной фагом петлей(1105-1106 корпускул в 1 мл) или двухслойным методом, должно быть стерильное пятно. Иммуногенность производственной культуры проверяют на морских свинках массой (30050) г и оценивают по величине 50. Для иммунизации используют односуточную агаровую культуру второй генерации, выращенную при температуре(271) С. Микробную взвесь, равную по концентрации 10 единицам ОСО мутности готовят в 22420 0,9 растворе натрия хлорида и вводят морским свинкам в объеме 0,5 мл шприцем, вместимостью 1 мл (ГОСТ 18137-77) с пределом отклонений по вместимости 0,05 мл подкожно в дозах 40, 200, 1000 и 5000 микробных тел. На каждую дозу берут по 10 животных. Контрольное заражение животных проводят на 21 сут после иммунизации. Заражающая подкожная доза для морских свинок составляет 200(100) вирулентного штамма чумного микроба, 1 которого не должна превышать для этих видов животных 100 микробных тел. Одновременно для контроля заражают 10 неиммунизированных морских свинок, из низ 5 - 1 и 5 - 200 . Все животные контрольной группы должны погибнуть от чумы в течение первых суток. За иммунизированными животными наблюдают в течение 20 сут после заражения вирулентной культурой чумы. 50 вычисляют по формуле 50( - 0,5), где- логарифм кратности разведений- логарифм максимальной иммунизирующей (фактической) дозы- отношение числа животных, выживших при иммунизации данной дозой, к общему числу,которым эта доза была введена индекс 1 соответствует номеру дозы,если считать наименьшую из испытанных доз первой- сумма значений , найденных для всех испытанных доз. Производственную культуру готовят из расчета использования ее максимально длительный срок без новых пересевов, что является одним из главных условий выпуска безопасной и стандартной вакцины. Перед приготовлением производственной культуры проводят анимализацию вакцинного штамма путем пассажа через организм морской свинки. Ампулу с сухой культурой штаммавскрывают с соблюдением правил асептики,разводят ее содержимое 0,9 раствором натрия хлорида и засевают микробной взвесью ряд пробирок со скошенным агаром Хоттингера(исходная культура или культура 1 генерации). Одновременно контролируют ее культуральноморфологические и ферментативные свойства,высевая взвесь в 2 пробирки с бульоном Хоттингера, на пестрый ряд, в который входят по 2 пробирки со средами Гисса с сахарозой, лактозой,рамнозой, глицерином, к которым добавлен индикатор Андреде, а также на 6 чашек с агаром Хоттингера, 3 чашки из этого количества используют для рассева с целью получения изолированных колоний. Три чашки с агаром помещают на 48 ч при температуре (371) С, все остальные среды на тот же срок при температуре(271) С. В том случае, если культура чистая,морфология колоний типичная для чумного микроба явления диссоциации отсутствуют и вакцинный штамм стойко удерживает свой биохимический тип,исходную культуру 1 генерации пересевают в пробирки (культурагенерации) и флаконы со скошенным агаром,Посевы инкубируют одни сутки при температуре(271) С. Оставшиеся пробирки с двухсуточной исходной культурой ( генерация) запаивают и хранят при температуре (42) С на случай необходимости повторения посевов. Через сутки пробирки с культуройгенерации также запаивают и помещают для хранения при температуре (42) С. Агаровую культуру во флаконах используют для анимализации. Анимализацию культуры через организм морской свинки производят следующим образом. Флаконы с посевами просматривают макроскопически,культуру смывают 0,9 раствором натрия хлорида, контролируют на отсутствие посторонней микрофлоры бактерископическим методом,разводят до концентрации 1109 и 5109 м.к./мл и каждую дозу вводят под кожу паховой области 6 морским свинкам в объеме 1 мл. Животных забивают на четвертые сутки после введения культуры. На чашки Петри с агаром Хоттингера рН (7,10,1) и стимулятором роста засевают методом отпечатков ткань из места введения,регионарных лимфатических узлов (пахового и подвздошного),селезенки. Селезенку удаляют асептически, помещают в стерильную чашку Петри. Посев производят в боксе для стерильной работы. Каждый орган и ткань засевают на отдельную чашку Петри. В качестве стимуляторов роста к питательным средам перед розливом их в чашки Петри добавляют 10 г/л гемолизированной крови или 0,25 г/л свежеприготовленного прокипяченного сульфита натрия или 5 г/л сарцинного стимулятора роста чумного микроба. После 48 ч инкубирования при температуре (271) С посевы просматривают и отбирают типичные колонии. Выросшие колонии пересевают на скошенный агар в пробирках (от каждого органа и ткани в отдельную пробирку). При посеве необходимо брать вес типичные колонии,выросшие в посевах селезенки. Если выросли единичные колонии, следует брать колонии,выросшие в посевах подвздошного и регионарного лимфатических узлов (максимальное количество колоний). После 24 ч инкубирования при температуре (271) С анимализированную культуру из пробирок пересевают на скошенный агар во флаконах или матрацах для последующего приготовления посевной культуры. Односуточную культуру на скошенном агаре во флаконах(через 24 ч инкубирования) просматривают макроскопически,чистую микробную массу смывают 0,9 раствором натрия хлорида. Полученную микробную взвесь контролируют на отсутствие посторонней микрофлоры бактериоскопическим методом. Чистой микробной культурой засевают 15-20 матрацев с агаром Хоттингера. В каждый матрац засевают микробную взвесь из одного флакона. Остатки посевной культуры контролируют на отсутствие посторонней микрофлоры путем высева ее на 3 3 22420 чашки с агаром Хоттингера рН (7,30,1), которые помещают при температуре (271) С. Засеянные матрацы инкубируют при температуре (271) С в течение 24 ч. По истечении этого срока посевы в матрацах просматривают макроскопически, микробную массу смывают в бутыль с (50,5) л бульона Хоттингера рН (7,10,1),отбирают пробы для контроля морфологии клеток и на отсутствие посторонней микрофлоры. Выращивание производственной культуры проводят на плотной питательной среде (агар из ферментативного гидролизата мяса по Хоттингеру или казеиновый агар, рН (7,10,1), аминный азот(12520) мгв аппарате культиваторе микробов Шестеренко (АКМ-Ш). После 48 ч роста при температуре (271) С микробную массу смывают средой высушивания,содержащей 10 сахарозы, 1 желатины, 1,5 глютаминово-кислого натрия, 0,5 тиомочевины и 0,05 пептона (агар Хоттингера - остальное). Смытую суспензию проверяют на отсутствие посторонней микрофлоры и производят розлив,замораживание, высушивание и опай. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ приготовления противочумной вакцины,включающий культивирование вируса в организме животных с последующим получением зараженного вирусного материала, отличающийся тем, что культивируют вирус штаммаи проводят анимализацию вакцинного штамма путем пассажа через организм морских свинок, а в качестве вирусного материала используют ткань из места введения вирусного препарата, регионарные лимфатические узлы и селезенку инфицированных морских свинок.