Способ получения цитотоксической сыворотки для стимуляции репродуктивной функции бесплодных коров

(51) 61 35/16 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ применяющихся с лечебно-профилактической целью в клинической ветеринарной практике. Поставленная задача достигается путем иммунизации животных-продуцентов антигеном,изготовленным из фолликулярных тканей яичника с последующим взятием крови и отделением сыворотки. Использование препарата ускоряет приход коров в охоту, способствует возобновлению половых циклов у бесплодных коров, позволяет повысить оплодотворяемость, оказывает благоприятное влияние на течение беременности, росту и развитию плода в пренатальном и постнатальном периодах,улучшает прирост живой массы молодняка. Применение сыворотки стимулирует гемопоэз,мобилизует клеточные и гуморальные звенья иммунитета, регулирует гормональные взаимоотношения.(72) Заманбеков Нуртлеу Акжолтаевич Кобдикова Нурзила Карибасовна Корабаев Ерганат Мухамадиевич Байниязов Аслан Абдуханович(56) Минюшева З.Ш. Влияние овариоцитотоксической сыворотки на функции яичников// Труды Казанского института усовершенствования врачей, 1959.Т.2, с.105-202(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНК-ЦИИ БЕСПЛОДНЫХ КОРОВ(57) Изобретение относится к области иммунолопатологии репродуктивной функции самок сельскохозяйственных животных, в частности, к изготовлению иммунных цитотоксических сывороток, 22149 Изобретение относится к области иммунологии репродуктивной функции коров, в частности, к изготовлению иммунных цито-токсических сывороток,применяющихся с лечебнопрофилактической целью в клинической ветеринарной практике. Известен способ получения цитотоксической сыворотки путем иммунизации животных продуцентов антигеном из тканей с последующим взятием крови и отделением сыворотки, при этом в качестве антигена использует гомогенат тканей красного костного мозга, печени, легких, селезенки,лимфатических узлов. Богомолец А.А. /Антиретикулярная цитотоксическая сыворотка как средство патогенетической терапии// Сб. о лечебном действии антиретикулярной цитотоксической сыворотки АЦС, Уфа, 1942. с.9-29/ Цитотоксическая сыворотка,изготовленная таким способом, обладает малой эффективностью при применении на животных с целью нормализации функции половой системы самок сельскохозяйственных животных. Известен способ получения цитотоксической сыворотки путем иммунизации животныхпродуцентов антигеном из тканей с последующим взятием крови и отделением сыворотки, при этом в качестве антигена использует гомогенат тканей целого яичника /Минюшева З.Ш., Влияние овариоцитотоксической сыворотки на функции яичников. /Сб. трудов Казанского института усовершенствования врачей. 1959. Т.2. с.105-202/. Цитотоксическая сыворотка, изготовленная этим способом также обладает недостаточной стимулирующей эффективностью при применении с целью нормализации функции половой деятельности. Задачей настоящего изобретения является разработка нового способа изготовления цитотоксической сыворотки, обладающей высокой органотропностью к тканям фолликулов яичника и являющейся активным иммуномодулирующим,стимулирующим и лечебно-профилактическим препаратом, применяющимся для активизации функции яичников с последующим активным проявлением половой охоты у бесплодных коров,повышения оплодотворяемости, а так же улучшения течение беременности, рост и развитие плода. Поставленная задача достигается путем иммунизации животных-продуцентов антигеном,полученным из фолликулярных тканей яичника убойных коров с последующим взятием крови и отделением сыворотки. 1.Приготовление антигена В качестве животных-доноров используют убойных или вынужденно забитых нестельных коров, яичники у которых находятся на стадии созревания. Фолликулярные ткани яичников,используемые в качестве антигена для иммунизации продуцентов берут от свеже забитых и только от здоровых нетелей и коров. Полученные яичники помещают в стерильную емкость и доставляют к месту обработки не менее чем в течение 2-3-х часов, поместив емкость в 2 морозильную камеру холодильника, а при невозможности в лед. В стерильных условиях бокса яичники с фолликулами тщательно очищают от механических примесей, плотной соединительной ткани и жира, несколько раз промывают стерильным физиологическим раствором, после чего отделяют созревшие фолликулы. Отобранные и отмытые от крови фолликулы измельчают в гомогенизаторе. Полученная масса помещается в стерильную посуду и консервируется замораживанием в холодильной камере. Проверка изготовленного антигена на стерильность производится путем посева 2-ной взвеси антигена на физиологическом растворе на мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар и среду Китт-Тарроци по 0,05 см 3,затем выдерживается в течение 7 дней в термостате при температуре 37 С. 2. Схема иммунизации животных Под иммунизацию для получения фолликулостимулирующей цитотоксической сыворотки отбираются здоровые, упитанные животные(кролики, бараны-валухи, ослы, жеребцы) Отобранным животным интраперитонеально вводится 5-ная взвесь антигена на стерильном физрастворе, в возрастающих дозах, в зависимости от вида иммунизируемого животного кроликам - 2 см 3 4 см 3 6 см 3 8 см 3 10 см 3 баранам- 5 см 3 10 см 3 15 см 3 20 см 3 25 см 3 ослам- 10 см 3 20 см 3 30 см 3 40 см 3 50 см 3 жеребцам - 20 см 3 30 см 3 40 см 3 50 см 3 60 см 3. Интервал между инъекциями антигена составляет 7 дней. Спустя 10 дней после последней инъекции антигена от продуцентов берется небольшое количество крови и устанавливается ее титр (активность) по реакции связывания комплемента (РСК) или по реакции преципитации (РП). Сыворотка считается активной,если она имеет титр не менее 1100. В случае, если сыворотка будет иметь титр ниже, чем 1100, то иммунизированным животным повторно производится введение 5 взвеси антигена в поддерживающей дозе кроликам 10 см 3 баранам 25 см 3 ослам 50 см 3 жеребцам 60 см 3. После достижения нужного титра иммунизированные животные дробно или тотально обескровливаются. Кровь подвергается отстаиванию в течение 12-24 часов для получения сыворотки. Полученная сыворотка консервируется 5 -ной карболизированным физиологическим раствором до 0,5 концентрации, затем разливается в стерильные ампулы различной емкости и запаеваются. Ампулы хранятся в холодильнике при температуре 4 С. Срок хранения готовых сывороток 2 года с периодическим определением титра перед употреблением. На стерильность ФСЦС проверяется по общепринятой в микробиологической практике методике путем посева на мясо-пептонный бульон,мясо-пептонный агар и среду Китт-Тарроци по 0,05 см 3, с последующей выдержкой 7 дней в термостате при температуре 37 С. На безвредность сыворотка проверяется путем подкожного ее введения кроликам в дозе 0,5 см 3 и морским свинкам 0,25 см . За животными ведется наблюдение в течение 10 дней. Отсутствие явных клинических симптомов заболеваний, потери в живой массе и случаев гибели животных указывает о безвредности изготовленного препарата. 3. Применение фолликулостимулирующей цитотоксической сыворотки Ампулы перед употреблением тщательно просматриваются и встряхиваются для равномерного распределения взвеси. Ампулы,имеющие на поверхности препарата плесень или пленку, а также с гнилостным запахом выбраковываются. Вскрытые ампулы используются в тот же день. Фолликулостимулирующая цитотоксическая сыворотка дозируется в зависимости от живой массы коров из расчета 0,5 см 3 нативной сыворотки на 100 кг массы тела. Сыворотка коровам вводится на 15-17 дни после отела двукратно, подкожно,интервал между введениями составляет 3-5 дней, в яловым и перегуливающим коровам сроки введения не ограничены. ФСЦС в стимулирующей дозе обладает выраженным иммунокоррегирующим воздействием на показатели неспецифической резистентности организма коров стимулирует гемопоэз, мобилизует клеточные и гуморальные звенья защиты иммунитета, регулирует взаимоотношения гормонов половых желез (эстрадиол, прогестерон) и гонадотропинов (ФСГ, ЛГ). Использование препарата ускоряет приход коров в охоту, позволяет повысить оплодотворяемость, а также оказывает благоприятное влияние на течение беременности,росту развитию плода в пренатальном и постнатальном периодах. При осуществлении изобретения в опытах на поголовье из 312 клинически здоровых коров, было установлено повышение оплодотворяемости животных до 95,4(в контроле 76) продолжительность дней бесплодия сократилась в среднем на 23 дня выхода приплода составила до 106, при сохранности в профилакторном периоде 101. В течение профилакторного периода телята,родившихся от стимулированных с ФСЦС коров развивается более динамично и меньше подвергаются к заболеваниям инфекционного и заразного характера. Среднесуточный прирост живой массы молодняка в среднем на 50-60 гр превосходит сверстников из контрольной группы. Использование изобретения с целью стимуляции репродуктивной функции бесплодных коров позволило повысить оплодотворяемость до 76,4 (в контроле 48,2). Возобновление половых циклов у бесплодных коров после введения препарата наступает у коров с продолжительностью бесплодия 1-30 дней на 20-22 сутки 31-60 дней на 25-30 сутки 91 и более дней на 38-45 сутки. Научнопроизводственные опыты проводилось на 162 коровах с различной продолжительности бесплодия. Новорожденные телята имели большую живую массу (на 1,3 кг) и не подвергается к заболеваниям. Экономическая эффективности изобретенного препарата по предотвращенному ущербу составила 4,62 тг. на 1 тг. затрат. Проведенными нами исследованиями установлено, что применение предложенного способа стимулирует гемопоэз, иммунологические показатели и активизируют обменные процессы. Так, под влиянием ФСЦС гематологические показатели (эритроциты, лейкоциты, гемоглобин) в день охоты увеличиваются соответственно на 19,4 17,7 и 5,2, а уровень общего белка - да 9,1. Иммунизация коров ФСЦС позволяет мобилизовать клеточные и гуморальные звенья иммунитета у бесплодных коров. Так, максимальное повышение лизоцимной, бактерицидной, комплементарной и фагоцитарной активности крови под влиянием препарата составило соответственно 19,5 9,7 12,6 и 4,5. Доказательством органотропности изобретаемого препарата явилось, влияния его на половые железы. Под влиянием ФСЦС повышение уровня гормона эстрадиола в предовуляторный период составило 10,280,31 нг/см 3, а в день половой охоты- 21,621,32 нг/см 3. Уровень лютенизирующего и фолликулостимулирующих гормонов (ЛГ, ФСГ) повышались соответственно до 14,280,22 и 10,550,19 нг/см 3. Под влиянием ФСЦС улучшается воспроизводительная функция бесплодных коров,где оплодотворяемость составила 79,2. Экономическая эффективность от применения ФСЦС в расчете на 1 корову составила 2855,20 тг, а эффективность по предотвращенному ущербу на 1 тг затрат-7,68 тг. Сравнительные данные с другим прототипом аналогичного действия (овариоцитотоксическая сыворотка - ОЦС) показали, что предложенный нами препарат обладает более выраженным стимулирующим эффектом на биохимические показатели и репродуктивную функцию коров. Применение ОЦС также активизирует обменные процессы, но по сравнению с ФСЦС менее выражены. Так,под влиянием ОЦС гематологические показатели (эритроциты, лейкоциты, гемоглобин) увеличивается в день охоты соответственно на 12,2 11,6 и 3,1, а уровень общего белка на 6,2. Повышение лизоцимной,бактерицидной, комплементарной и фагоцитарной активности крови под влиянием ОЦС составило соответственно 13,4 7,3 8,5 и 3,1 повышение уровня эстрадиола в предовуляторный период составило 8,020,46 нг/см 3, а в день половой охоты 17,360,32 нг/см 3. Применение ОЦС повышает оплодотворяемость бесплодных коров на 72,3 экономическая эффективность в расчете на 1 корову составила 2238,3 тг, а по предотвращенному ущербу на 1 тг затрат-5,03 тг. Таким образом, следует отметить, что сравнительный анализ по изучению влияния сывороток на биохимические показатели крови коров показал, что предлагаемый нами препарат(ФСЦС) обладает более выраженным 3 22149 стимулирующим действием, чем (ОЦС). Об этом также свидетельствуют результаты научнопроизводственных экспериментов и экономическая эффективность от применения препарата. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения цитотоксической сыворотки,включающий иммунизации животных-продуцентов антигеном из ткани яичника с последующим взятием крови и отделением сыворотки, отличающийся тем,что иммунизацию осуществляют антигеном, полученным из фолликулярных тканей яичников,иммунизацию осуществляют интраперитонеальным введением продуцентам 5-ной взвеси антигена на стерильном физрастворе в возрастающих дозах, в зависимости от вида животного кроликам - 2 см 3, 4 см 3, 6 см 3,8 см 3, 10 см 3 баранам - 5 см 3, 10 см 3, 15 см 3, 20 см 3,25 см 3 ослам-10 см 3, 20 см 3, 30 см 3, 40 см 3, 50 см 3 жеребцам - 20 см 3, 30 см 3, 40 см 3, 50 см 3, 60 см 3 с интервалом между инъекциями антигена 7 дней.