Ассоциированная вакцина против кампилобактериоза, сальмонеллеза и хламидиоза овец

(51)7 61 39/106, 61 39/112, 61 39/118 ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(72) Шманов Кайырбай СагинтаевичКараваев Юрий ДмитриевичИренков Иван Петрович Туякбаева Ботагоз МаратовнаСембина Фатима Егимбаевна(54) АССОЦИИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ КАМПИЛОБАКТЕРИОЗА, САЛЬМОНЕЛЛЕЗА И ХЛАМИДИОЗА ОВЕЦ(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и представляет собой инактивированную эмульсию-вакцину против кампилобактериозного, сальмонеллезного и хламидиозного абортов овец. Ассоциированная вакцина против кампилобактериоза, сальмонеллеза и хламидиоза овец содержит штаммы.30 ВИЭВ,8 ВИЭВ,1449 ВИЭВ,159 ВИЭВ,876 ВИЭВ,2 ВИЭВ, формалин и эмульгатор при следующем соотношении компонентов, об.(1 оболочка желточного мешка на 5 см 3 вакцины с активностью 106,5 ЭЛД 50/02 см 3) фомалин (содержащий не менее 36,5 формальдегида) 0,2-0,5 эмульгатор 48-50. Предложенная ассоциированная вакцина стабильна, безвредна, обладает высокой иммуногенностью и создает напряженный иммунитет как против кампилобактериозного и хламидиозного абортов,так и против сальмонеллезного аборта овец. 8507 Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и представляет собой инактивированную эмульсию-вакцину против кампилобактериозного, сальмонеллезного и хламидиозного абортов овец. В имеющихся в нашем распоряжении источниках информации сведения о существовании вакцины,создающей иммунитет одновременно против кампилобактериоза, сальмонеллеза и хламидиоза овец, не обнаружены. Задачей изобретения является создание стабильной, безвредной, высокоиммуногенной, создающей напряженный иммунитет ассоциированной вакцины против кампилобактериоза, сальмонеллеза и хламидиоза овец. Ассоциированная вакцина против кампилобактериоза, сальмонеллеза и хламидиоза овец содержит штаммы.30 ВИЭВ,8 ВИЭВ,1449 ВИЭВ,159 ВИЭВ,876 ВИЭВ,2 ВИЭВ, формалин и эмульгатор при следующем соотношении компонентов, об. штамм.30 ВИЭВ (100 млрд. микробных 15-17 клеток в 1 см 3) штамм 8 ВИЭВ(1 оболочка желточного мешка на 5 см 3 вакцины с активностью 106,5 ЭЛД 50/02 см 3) Штаммы, используемые для изготовления ассоциированной вакцины,.30 ВИЭВ,8 ВИЭВ,1449 ВИЭВ,159 ВИЭВ,876 ВИЭВ,2 ВИЭВ депонированы в ВГНКИ. Пример 1. Приготовление питательных сред для культивирования сальмонелл и родококков. Культивирование сальмонелл и родококка проводится на бульоне Хоттингера, который готовят из перевара Хоттингера путем разбавления его дистил 2 лированной водой до содержания в питательной среде 140-160 мг аминного азота, смесь подогревают до кипения, после чего в не добавляют 0,5 пептона, 5 аминопептида. Подщелачивают 10 раствором гидрата окиси натрия до рН 7,4-7,6. Среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, стерилизуют при 120 С 30 мин, рН среды - 7,0-7,2. Пример 2. Культивирование сальмонелл и родококка. Вакцинные культуры сальмонелл должны обладать активным движением, что необходимо контролировать не только микроскопически, но также высевом их на полужидкие питательные среды. Перед получением бактериальной массы необходимо пересеять культуры 3-4 раза (с интервалом 1 сутки) на ПЖА (полужидкий агар) в пробирках и затем на МПБ (мясопептонный бульон). Культуры сальмонелл и родококка, выросшие в течение 24 ч в пробирках с МПБ, пересевают во флаконы со средой Хоттингера и 5 аминопептида из расчета 1 пробирка на 1 флакон. Культивируют в течение 2 суток при 37 С. Вышеуказанные культуры, выращенные во флаконах со средой Хоттингера, через сифон перекачивают в 16-литровые баллоны с 7-8 литрами бульона ттингера по 2 баллона на каждую культуру сальмонелл. После посева баллоны помещают в термостатную комнату при 37 С на шуттельаппарат с частотой вращения платформы аппарата 90-120 оборотов в минут. Культивируют 24-48 часов. Затем выращенные культуры переносят из баллонов в ферментеры емкостью от 0,1 до 1 м 3, где поддерживают в среде в пределах 20 уровень растворенного кислорода (О 2) до начала интенсивного роста культуры,затем рО 2 доводят до 40 и поддерживают так до конца культивирования путем расхода воздуха на аэрацию. Обороты мешалки 5060 в минуту у крупных ферментеров. Продолжительность культивирования - 24 ч. Полученные культуры с соблюдением стерильности перекачивают в реактор-инактиватор. Пример 3. Инактивация и концентрация бактериальной массы. Инактивируют бактериальную массу, добавляя формалин до концентрации формальдегида 0,2 и выдерживают в течение 3 суток при 37 С, перемешивая 3-4 раза в сутки. По истечении указанного времени инактивации культуральную жидкость проверяют на стерильность путм высева в две пробирки с каждой средой МПА (мясопептонный агар),МПБ, ПЖА, среду Сабуро. Культивируют в течение 10 суток при 37 С. Роста культур микроорганизмов на всех средах не должно быть. Инактивированные культуры микроорганизмов сохраняют при 17-20 С путем подачи воды в рубашку реактора, концентрируют методом центрифугирования или сепарирования. Пример 4. Приготовление питательных сред для культивирования кампилобактерий. Для культивирования кампилобактерий в производстве используют среду на основе перевара Хот 8507 тингера, из которого готовят бульон Хоттингера путм разбавления его дистиллированной водой до содержания в питательной среде аминного азота 140-160 мг смесь подогревают до кипения, после чего в не добавляют 0,5 химически чистой поваренной соли, 0,5 пептона, 0,025 железа сернокислого закисного и 5 аминопептида. Подщелачивают 10 раствором гидрата окиси натрия до рН 7,4-7,6. После стерилизации рН среды доводят до 7,0-7,2. Пример 5. Культивирование производственных штаммов кампилобактерий. Содержимое ампулы растворяют в 1 см 3 МПБ,содержащего 10 стерильной дефибринированной крови барана, и рассеивают в 3-4 пробирки с ПЖА и 5 аминопептида. Затем через 2 суток культивирования при 37 С культуру пересевают во флаконы из расчета 1 пробирка на 1-2 флакона. Типичную культуру кампилобактерий, выращенную во флаконах с ПЖА, отсасывают пипеткой Мора и засевают на 23 матраса с той же средой из расчета по 30-50 см 3 культуры на матрас. Культуру штамма кампилобактерий, полученную в матрасах, через сифон перекачивают в 16-литровые баллоны с 7-8 литрами производственной жидкой питательной среды, предварительно проверенной на стерильность в течение 2-3 суток при 37 С. После посева баллоны помещают в термостатную комнату при 37 С на шуттель-аппарат с частотой вращения платформы 90-120 об/ мин. В баллоны через ротаметр пропускают азот 0,5 л в минуту в течение 20 мин и через 1,5-3 ч воздух. Время культивирования 26 ч. Полученную бактериальную массу проверяют на чистоту роста микроскопированием и высевают на МПБ, ПЖА и МППБ (мясопептонный печеночный бульон). Через 5 суток на ПЖА должен быть характерный рост, а на МПБ и МППБ роста не должно быть. Затем чистая культура кампилобактерий пересевается в ферментеры, где культивируется 10-12 ч, уровень растворнного кислорода (рО 2) поддерживают в пределах 40 . Полученную культуру кампилобактерий с соблюдением стерильности перекачивают в реакторинактиватор. Пример 6. Инактивация и концентрация бактериальной массы. К полученной культуре кампилобактерий добавляют формалин до концентрации формальдегида 0,2 и выдерживают в течение 3 суток при температуре 37 С. По истечении времени инактивации культуральную жидкость проверяют на стерильность путм высева на среды МПА, МПБ, ПЖА, МППБ,среду Сабуро. Посевы выдерживают 10 суток при 37 С. Роста культур микроорганизмов на всех средах не должно быть. Инактивированную культуру кампилобактерий после инактивации сохраняют при 17-20 С путем подачи воды в рубашку реактораинактиватора. Инактивированную баксуспензию концентрируют методом центрифугирования или сепарирования. Пример 7. Требования к инкубационным яйцам при получении производственных партий хламидий. Для инкубации используют куриные яйца, в грамме желтка которых содержится в микрограммах витамин В 2 4-6, каратиноидов не менее 15 и витамина А 6-8 ИЕ. Проверку на наличие витаминов и каратиноидов проводят периодически не реже одного раза в месяц. Инкубационное яйцо должно быть правильной формы, чистым, с гладкой, цельной и плотной скорлупой, при овоскопии желток просматривается в центре яйца. Воздушная камера должна быть в тупом конце яйца, неподвижна. Перед закладкой в инкубатор все яйца должны быть подвергнуты дезинфекции парами формальдегида. Пример 8. Приготовление материала матровой расплодки для заражения РКЭ и заражение производственной партии куриных эмбрионов. Штамм хламидий пассажируют на 6-7-суточных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) до накопления его в титре не ниже 106 ЭЛД 50/0,2, для контроля иммуногенности титр должен быть не менее 106,5 ЭЛД 50/0,2 см 3. Матровую расплодку можно готовить из лиофилизированного или нативного материала, полученного из ВГНКИ ветпрепаратов, или же используют в качестве матры хламидиосодержащие оболочки желточных мешков, взятых из очередных производственных партий хламидий. Матровую расплодку хламидий размораживают при 37 С, добавляют фосфатно-буферный физиологический раствор или раствор Хенкса рН 7,2-7,4 до разведения 10-1. В полученную суспензию добавляют гентамицин из расчета 150 мг на 1 литр. Из этой суспензии делают разведение хламидий 10-2-10-3. Указанными разведениями заражают РКЭ и инкубируют. Погибшие эмбрионы на 4-9 сутки вскрывают. Содержимое эмбриона - желточные мешки, желток, аллантоисную жидкость, аллантоисные оболочки используют полностью, помещают в стерильные бутыли объемом 3 литра с соблюдением правил асептики. При наличии хламидий в 70 мазков отпечатков материал используют для приготовления вакцины. Пример 9. Концентрация и инактивация хламидий. Стеклянные бутыли с хламидиосодержащим материалом измельчают на коллоидной мельнице в течение 5-6 минут при скорости вращения ножей 3-4 тысяч об/мин. Гомогенат сливают в бутыли или реактор, добавляют равный объм фосфатно - буферного физиологического раствора Хенкса с рН 7,27,4. Суспензию охлаждают и центрифугируют. Центрифугат (надосадочная жидкость) собирают в бутыли или реактор, осадок уничтожают. В суспензию хламидий добавляют формалин до концентрации формальдегида 0,16 и выдерживают в течение 4 суток при 37 С. Периодически встряхивают 2-3 раза в сутки. Инактивация хламидий контролируется путем инокуляции в желточный мешок десяти РКЭ материала в разведении 1100. В случае гибели эмбрионов на 4 сутки их вскрывают, делают мазкиотпечатки, просматривают под микроскопом для обнаружения хламидий. Если в мазках обнаружены 3 8507 хламидии, суспензию снова инактивируют при 37 С в течение 6 суток. Контроль бактериальной и микологической стерильности осуществляется путем высева испытуемых проб инактивированной суспензии хламидий на питательные среды МПА, МПБ,МППБ и среду Сабуро. В питательных средах не должно быть роста микроорганизмов. Пример 10. Изготовление 100 литров ассоциированной вакцины. Берут масло-ланолиновую смесь(масло минеральноеланолин) в соотношении 11 в количестве 49,6 литров, загружают в реактор и стерилизуют при температуре 120 С в течение 2 часов. Затем понижают температуру масло-ланолиновой смеси до 30 С. Далее готовят смесь баксуспензий, причем предварительно каждый из используемых штаммов, входящих в баксуспензию, инактивируется формалином, как указано в примерах 3, 6, 9, причем общий объем доли формалина составляет 0,4 л. На изготовление 100 литров ассоциированной вакцины используется смесь баксуспензий, включающая кампилобактерии в объеме 16,8 л хламидиозной суспензии - 16,6 л сальмонеллезной суспензии - 12,85 л (- 4,15 л,- 4,15 л и- 4,55 л) и суспензии- 4,15 л. Итого количество бактериальной смеси составляет 50,4 л. Баксуспензию и масло-ланолиновую смесь добавляют соответственно в количестве 50,4 и 49,6 литров. После перекачки баксуспензии в реактор производят гомогенизацию при температуре 30 С в течение 30 минут и получают целевой продукт. В момент расфасовки эмульгаторный аппарат включают на 15-20 минут. Расфасовку ведут под давлением 2 атм. Стабильность вакцины проверяют путем нагрева в термостате при 37-38 С в течение 10 суток. По истечении указанного срока расслоения вакцины на эмульсию и водную фазу не должно быть. Допускается отслоение масла на поверхности вакцины до 3 см. Стерильность вакцины определяется путем высева на питательные среды МПБ, МППБ, МПА, среду Сабуро. Безвредность вакцины определяют подкожным введением 10 белым мышам ее смеси из 5 флаконов в дозе 0,3 см 3 в область спины. В течение 10 суток наблюдения вакцина не должна вызывать заболевания и гибели лабораторных животных. Антигенную активность вакцины определяют путем прививки 5 кроликам и установления титра антител в РА (реакции агглютинации) через 25 суток после вакцинации. Кроликам вводят вакцину внутримышечно в область бедра в дозе 1 см 3 и через 21 сутки берут кровь для постановки в РА с кампилобактериозным антигеном подвида фетус и паратифозным антигеном аборта овец. Титр антител у вак цинированных кроликов должен быть не ниже 1200, для сальмонелл титр антител 1400. Иммуногенность проверяют на морских свинках,смесь вакцины вводят подкожно в дозе по 0,5 см 3. Через 27 суток после вакцинации получают кровь,которую исследуют в РСК (реакции связывания комплемента) с хламидиозным антигеном. Вакцину считают иммуногенной, если в сыворотках крови морских свинок на 27 сутки после вакцинации выявляются в РСК противохламидийные антитела в титрах не ниже, чем 116-32 на четыре, три креста, соответственно, и не меньше, чем у 50 животных. Полученные положительные результаты показывают, что данная вакцина по своей эффективности не уступает моновакцинам, а в организме иммунизированных животных вырабатывается достаточно стойкий иммунитет. Кроме того, данная ассоциированная вакцина очень удобна для применения, облегчает труд ветеринарных специалистов. Вакцина вводится однократно. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Ассоциированная вакцина против кампилобактериоза, сальмонеллеза и хламидиоза овец, отличающаяся тем, что она содержит штаммы.30 ВИЭВ,8 ВИЭВ,1449 ВИЭВ,159 ВИЭВ,876 ВИЭВ,2 ВИЭВ, формалин и эмульгатор при следующем соотношении компонентов, об. штамм.30 ВИЭВ (100 млрд. микробных 15-17 клеток в 1 см 3) штамм 8 ВИЭВ(1 оболочка желточного мешка на 5 см 3 вакцины с активностью 106,5 ЭЛД 50/02 см 3)