Способ тестирования растений картофеля на вирусоносительство

(51) 12 7/00 (2006.01) 01 33/53 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к области безвирусного семеноводства картофеля, в частности к способу иммунологической диагностики растений на вирусоносительство. Технической задачей изобретения является упрощение и удешевление иммунологической диагностики растений картофеля на вирусоносительство, которая достигается за счет сокращения времени инкубации растительных образцов (антигенов). Способ состоит в образовании комплекса между иммобилизованными на твердой фазе специфическими антивирусными иммуноглобулинами с антигенами, инкубируемыми в термостате при 37 С в течение 2-х часов, с последующим образованием комплекса между антигенами с иммуноглобулинами, меченными ферментом и выявлением фермента-маркера в реакции с субстратом. Способ тестирования значительно снижает трудоемкость иммуноферментного анализа, упрощает методику тестирования и может быть успешно использован как при получении безвирусного семенного материала картофеля в первичных звеньях семеноводческого процесса, так и на уровне серийных полевых испытаний при выявлении общей пораженности растений.(72) Аяганова Динара Аблаевна Ералинов Алибек Болатович Жакупов Абылайхан Абидатович Смагулов Азамат Сенбаевич Хасанов Вадим Тагирович Швидченко Владимир Корнеевич(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(56) Бобкова А.Ф. и др. Диагностика -вируса картофеля методом иммуноферментного анализа // Известия Академии наук СССР. -//. 1984. 27. . 353-364. Чирков С.Н. Иммунохимическая и молекулярная диагностика вирусных инфекций растений // Автореф. дисд.м.н., М., 2009. с.51(54) СПОСОБ ТЕСТИРОВАНИЯ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ НА ВИРУСОНОСИТЕЛЬСТВО Изобретение относится к области безвирусного семеноводства картофеля,в частности к иммунологической диагностике растений на вирусоносительство. Известен способ диагностики растений картофеля на основе иммуно-ферментного анализа(ИФА). Чувствительность данного способа составляет 1-10 нг вируса/мл. В настоящее время ИФА применяется в трех основных модификациях прямой метод, непрямой метод и метод двойных антител. Принцип метода двойных антител (сэндвич-вариант ИФА) заключается в образовании комплекса между иммобилизованными на твердой фазе, специфическими антивирусными иммуноглобулинами с антигенами и иммуноглобулинами, меченными ферментом с последующим выявлением фермента-маркера в реакции с субстратом. Сущность прямого варианта иммуноферментного анализа состоит в том, что сенсибилизацию плат иммуноглобулинами не проводят, а антиген сорбируют непосредственно на поверхности. В лунки плат вносят иммуноглобулины, меченные ферментом лунок с последующим выявлением фермента-маркера в реакции с субстратом. Непрямой вариант иммуноферментного анализа заключается в том, что на первой стадии реакции в лунки полистирольных плат вносят антиген (вирусный препарат или сок растений), добавляют сыворотку, предназначенную для испытания, инкубируют и отмывают антитела,не образовавшие комплекс с антигенами. На второй стадии реакции в лунки плат вносят антивидовые глобулины, меченные ферментом (конъюгаты),которые вступают во взаимодействие с антителами исследуемой сыворотки. Например, если в роли испытуемого образца выступают антитела кролика,то ферментом метят антикроличью сыворотку осла или козы (А.Ф. Бобкова, С.Н. Чирков. Применение иммуноферментного анализа для диагностики вирусных заболеваний растений (обзор) // Сельскохозяйственная биология, М. Колос, 1983,5, с.32-35. О.В. Николаева. Современные иммунологические методы в массовой диагностике вирусов растений. Обзорная информация, М., 1986,52 с.). Из всех известных способов наиболее близким по совокупности признаков и достигаемому положительному эффекту (прототипом) является способ диагностики растений картофеля на основе метода двойных антител (сэндвич-вариант ИФА),который заключается в образовании комплекса между иммобилизованными на твердой фазе специфическими антивирусными иммуноглобулинами с антигенами, инкубируемыми при 4 С в течение 10-14 часов,и иммуноглобулинами, меченными ферментом с последующим выявлением фермента-маркера в реакции с субстратом(О.В. Николаева. Современные иммунологические методы в массовой диагностике вирусов растений стр.13-14). Недостатком данного способа тестирования картофеля на наличие вирусной инфекции является то, что растительные образцы картофеля,2 сенсибилизированные на лунках планшет,инкубируют в течение 10-14 часов. Длительная инкубация антигенов затягивает работу по проведению ИФА. Технической задачей изобретения является упрощение и снижение трудоемкости иммунологической диагностики растений картофеля на вирусоносительство, которая достигается за счет сокращения времени инкубации растительных образцов (антигенов). Способ состоит в образовании комплекса между иммобилизованными на твердой фазе специфическими антивирусными иммуноглобулинами с антигенами, инкубируемыми в термостате при температуре 37 С в течение 2-х часов, повышающих качество результатов тестирования, с последующим образованием комплекса между антигенами с иммуноглобулинами, меченными ферментом и выявлением фермента-маркера в реакции с субстратом методом ИФА с помощью спектрофотометра при длине волны 490 нм. Сущность предлагаемого способа раскрывается следующим примером. На первом этапе тестирования растений картофеля на вирусоносительство методом ИФА в лунки полистирольных плат раскапывают специфическую антивирусную сыворотку(иммуноглобулины,антитела) в разведении 20 мкл антител на 10 мл покровного буфера и инкубируют в течение 2-х часов в термостате при температуре 37 С. После инкубации каждого компонента проводят промывку лунок планшет и промывочными растворами(дистиллированной водой с детергентом, -Т). Все растворы реагентов вносят в объеме 100 мкл на 1 лунку платы. На втором этапе из листьев или клубней картофеля готовят растительные образцы из расчета на 0,1 г растительной ткани - 0,5-1,0 мл пробно-конъюгатного буфера. Растительные образцы раскапывают в лунки плат и инкубируют в термостате при 37 С в течение 2-х часов вместо стандартного режима инкубации 10-14 часов в холодильнике при 4 С. На третьем этапе в лунки плат наносят конъюгаты - иммуноглобулины с ферментной меткой (ковалентно связанные с пероксидазой хрена антитела против вирусных антигенов) в разведении 20 мкл на 10 мл буфера для проб и конъюгатов, которые инкубируют в течение 1-го часа в термостате при 37 С. На заключительном этапе ИФА проводят ферментативную реакцию с субстратом,сопровождающуюся образованием окрашенного продукта и считывают результаты тестирования с помощью спектрофотометра при длине волны 490 нм с остановкой реакции 24. В проводимом эксперименте по тестированию сортообразцов картофеля использовали следующие варианты ИФА с различными режимами инкубации растительных образцов 1. 15 часов (ночь) в холодильнике при температуре 4 С - сэндвич- вариант ИФА контроль 2. 15 часов (ночь) в холодильнике при температуре 4 С - прямой вариант ИФА 3. 2 часа в термостате при температуре 37 С сэндвич-вариант ИФА 4. 2 часа в термостате при температуре 37 С прямой вариант ИФА. 5. 1 час в термостате при температуре 37 С сэндвич вариант ИФА 6. 1 час в термостате при температуре 37 С прямой вариант ИФА. Результаты эксперимента приведены в таблице 1. Таблица 1 Оптимизация времени инкубации вирусного антигена Вариант опыта Сэндвич Согласно приведенным данным таблицы 1,наибольшее количество зараженных образцов было выявлено в варианте с применением сэндвич варианта ИФА при 2-х часовой инкубации антигенов и температуре 37 С. Данный вариант не уступал, а в случае вирусовипревышал по чувствительности контрольный вариант. Сокращение времени инкубации вирусного антигена до 1 часа при температуре 37 С в различных вариантах ИФА оказалось малоэффективным. Способ тестирования значительно, значительно снижает трудоемкость иммуноферментного анализа,упрощает методику тестирования и может быть успешно использован как при получении безвирусного семенного материала картофеля в первичных звеньях семеноводческого процесса, так и на уровне серийных полевых испытаний при выявлении общей пораженности растений. Преимуществом способа является повышение чувствительности иммуноферментного анализа и получение результатов диагностики в течение одного дня. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ тестирования растений картофеля на вирусоносительство, включающий образование комплекса между иммобилизованными на твердой фазе специфическими антивирусными иммуноглобулинами с антигенами, инкубируемыми при температуре 4 С в течение 10-14 часов, и иммуноглобулинами, меченными ферментом с последующим выявлением фермента-маркера в реакции с субстратом, отличающийся тем, что при образовании комплекса между иммобилизованными на твердой фазе специфическими антивирусными иммуноглобулинами с антигенами, последние инкубируют в термостате при температуре 37 С в течение 2-х часов, с последующим образованием комплекса между антигенами с иммуноглобулинами, меченными ферментом и выявлением фермента-маркера в реакции с субстратом методом ИФА с помощью спектрофотометра при длине волны 490 нм.