Способ определения антител против возбудителя бруцеллеза

(51) 01 33/535 (2006.01) 61 39/10 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ВОЗБУДИТЕЛЯ БРУЦЕЛЛЕЗА(57) Изобретение относится к области ветеринарии,в частности к способу диагностики бруцеллеза животных. Способ определения антител против возбудителя бруцеллеза включает сенсибилизацию полистироловой планшеты инактивированным корпускулярным антигеном из штамма 19 с последующим выявлением антител в сыворотках крови с помощью ферментной метки,причем для сенсибилизации полистироловой планшеты используют белки внешней мембраны 19, а наличие антител определяют с помощью меченных ферментом иммуноглобулинов против видового . Предложенный способ является более чувствительным по сравнению с общепринятыми серологическими реакциями, а также ИФА, в котором в качестве антигена используется корпускулярный антиген из штамма 19. Использование предлагаемого способа в ветеринарной практике позволит повысить эффективность проводимых мероприятий за счет более полного выявления инфицированных бруцеллезом животных.(72) Шенжанов Канат Толюбаевич Сураншиев Жанболат Амреевич Булашев Айтбай Кабыкешович Оспанова Сауле Гельмановна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Казахский государственный агротехнический университет им. С. Сейфуллина Министерства сельского хозяйства Республики Казахстан(6)5718903, 17.02.98, кл. А 61 К 39/10, 12 1/21 (6) Шумилов К.В. и др. ИФА для дифференциальной диагностики иерсиниоза и бруцеллеза у крупного рогатого скота. // РЖ Ветеринария, М., ЦНХБС, 2, 2002, 543 реферат 19230 Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к способу диагностики бруцеллеза животных. Известны способы определения антител против возбудителя бруцеллеза сельскохозяйственных животных реакция агглютинации (РА), реакция связывания комплемента(РСК),реакция длительного связывания комплемента (РДСК),пластинчатая реакция с роз-бенгал антигеном (РБП),кольцевая реакция с молоком (КР), основанные на обнаружении антител к корпускулярному антигену возбудителя болезни в сыворотке крови животных(Лабораторные исследования в ветеринарии / Под ред. Антонова Б.И. М. Агропромиздат, 1986). Недостатком является их низкая чувствительность. Описан способ определения антител против возбудителя бруцеллеза у крупного рогатого скота,предусматривающий использование в серологических реакциях конглютинина (Сайдулдин Т.О. Основы серологии. Алма-Ата, 1992, 272 с.) и раствора трилона Б (а. с. СССР 1091908, кл. А 61 В 10/00, 1984). К недостаткам приведенного способа,основанного на феноменах агглютинации и комплементсвязывания, является его низкая чувствительность,что обуславливает необходимость многократного исследования животных для полного выявления всех инфицированных. Одним из высокочувствительных и легковыполнимых аналитических способов,используемых в иммунологии,является твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Последний находит свое применение и в диагностике особо опасных инфекционных болезней человека и животных, в том числе бруцеллеза. Известен способ определения антител против возбудителя бруцеллеза крупного рогатого скота, включающий использование в качестве твердой фазы полистироловых планшет,сенсибилизированных инактивированным корпускулярным антигеноми одновременно аналогичными антигенами 19 и 03 (а. с.2152035, кл. 01 33/535, 61 К 39/00, 39/10, 2000). Однако способ не лишен недостатков. Корпускулярные антигены (цельные клетки)19 и 03,применяемые в данном способе, на своей поверхности,наряду со специфичными детерминантами, содержат и антигены, общие с другими близкородственными грамотрицательными микроорганизмами, что не только снижает чувствительность, но и специфичность ИФА. Задачей изобретения является разработка способа, позволяющего повысить чувствительность ИФА при определении антител против возбудителя,что позволит наиболее точно выявить инфицированных бруцеллезом животных. Способ определения антител против возбудителя бруцеллеза включает сенсибилизацию полистироловой планшеты инактивированным 2 корпускулярным антигеном из штамма 19 с последующим выявлением антител в сыворотках крови с помощью ферментной метки,причем для сенсибилизации полистироловой планшеты используют белки внешней мембраны 19, а наличие антител определяют с помощью меченных ферментом иммуноглобулинов против видового . Результаты ИФА проявляют хромогеном и оценивают спектрофотометрически или визуально. Положительными считают пробы сывороток крови,средняя величина оптической плотности которых не менее 2,1 раза превосходит среднюю оптическую плотность контрольной отрицательной сыворотки. Способ осуществляется следующим образом. Выделяют белки внешней мембраны 19. Для этой цели двухсуточную культуру,выращенную на косом печеночно-глюкозоглицериновом агаре, смывают стерильным физиологическим раствором. Готовят суспензию бруцелл в концентрации 250-500 млн. микробных тел в 1 мл физиологического раствора и засевают колбы Тартаковского с печеночно-глюкозо-глицериновым агаром. После равномерного распределения посевного материала колбы помещают в термостат при температуре 37-38 С на 2 суток. После роста культуру смывают с поверхности питательной среды 50-80 мл стерильным физиологическим раствором с 0,5 -ной карболовой кислотой,микробную взвесь фильтруют через двойной слой марли с ватой в стерильные колбы и для инактивации бруцелл колбы выдерживают в термостате при температуре 37 С в течение 48 ч. Затем взвесь микроорганизмов трижды отмывают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 минут. Клеточный осадок ресуспендируют буфером для экстракции (0,1 М раствор цитрата натрия,содержащий 1 М хлорида натрия и 0,1 тритон Х 100, рН 7,5) из расчета на 12 и полученную клеточную взвесь и инкубируют при постоянном перемешивании в течение 16-18 часов при 37 С. Затем клеточную суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин, отбирают надосадочную жидкость и повторно центрифугируют в том же режиме. Отбирают надосадочную жидкость и диализуют против забуференного физиологического раствора с рН 7,4(ЗФР) в течение 16-18 часов при 4 С. Готовят конъюгат - комплекс, состоящий из кроличьих антител противкрупного рогатого скота и фермента пероксидазы хрена. С этой целью 4 мг пероксидазы хрена ( - 2,73,0) растворяют в 1 мл дистиллированной воды,прибавляют 0,2 мл свежеприготовленного 0,1 М раствора перийодата натрия и осторожно перемешивают в течение 20 минут при комнатной температуре. Приготовленный раствор фермента диализуют против 0,001 М ацетатного буфера (рН 4,4) в течение 18 часов при температуре 4 С. Затем в полученный альдегидный раствор пероксидазы вносят 0,02 мл 0,2 М бикарбонатного буфера (рН 9,5) и сразу же прибавляют 8 мг аффинных антител (антител противкрупного 19230 рогатого скота) в 0,01 М бикар-бонатном буфере (рН 9,5). Реакционную смесь выдерживают 2 ч в темноте при температуре 20 С, добавляют к ней 0,1 мл свежеприготовленного раствора боргидрида натрия и оставляют на 2 часа при 4 С. Затем диализуют против боратного буфера (16-18 часов, 4 С),прибавляют равный объем 60 глицерина в боратном буфере и хранят при 4 С. Определяют рабочий титр конъюгата методом шахматного титрования в непрямом варианте ИФА. За рабочий титр конъюгата принимают наибольшее его разведение, которое выявляеткрупного рогатого скота в концентрации не ниже 20-40 нг/мл. Конъюгат считается пригодным для использования,если имеет рабочий титр не менее 1500. Определяют оптимальные параметры постановки ИФА, в котором антигеном служат белки внешней мембраны 19. В лунки полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносят по 0,1 мл белков внешней мембраны.19 в концентрации 10 мкг/мл в ЗФР с рН 7,4. Для адсорбции антигена планшет закрывают крышкой и инкубируют при 4 С в течение 18 часов. После инкубации содержимое лунок планшета удаляют и отмывают трехкратно по 1-2 мин., заполняя лунки до верхнего края ЗФР с 0,05 твином 20 (ЗФР-ТВ). Готовят разведения 1400 контрольных (позитивной и отрицательной) и испытуемых сывороток в ЗФР-ТВ. Для этого в первый ряд чистых пробирок вносят по 0,45 мл, во второй - 0,45 мл и в третий по 0,3 мл ЗФР-ТВ. После этого в первый ряд пробирок вносят по 0,05 мл испытуемых и контрольных сывороток, тщательно перемешивают и переносят по 0,05 мл во второй ряд, тщательно перемешивают и переносят 0,1 мл в третий ряд. В третьем ряду пробирок получают разведение 1400. В 2 лунки планшета (А-1 и В-1) вносят по 0,1 мл разведенной 1400 контрольной позитивной сыворотки, в 2 лунки (С-1 и -1) вносят по 0,1 мл контрольной отрицательной сыворотки, в 4 лунки Е-1, -1 (контроль конъюгата) и -, -1 (контроль субстрата) вносят по 0,1 мл ЗФР-ТВ. В остальные лунки планшета вносят по 0,1 мл испытуемых сывороток в разведении 1400 в двух повторах, т.е. каждую пробу сыворотки вносят в 2 лунки (всего 45 проб сывороток на одну планшету). Планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 1 часа при температуре 37 С. После инкубации содержимое лунок планшета удаляют и отмывают вышеописанным способом. После процедуры отмывания во все лунки планшета, кроме лунок и -1, вносят по 0,1 мл рабочего раствора меченных ферментом антител против иммуноглобулиновкрупного рогатого скота. Планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 1 часа при 37 С. По истечении времени инкубации содержимое лунок удаляют, повторяют процедуру отмывки и во все лунки планшета вносят по 0,1 мл субстратной смеси. Субстратную смесь готовят непосредственно перед применением в 10 мл 0,05 М фосфатноцитратного буфера (рН 5,0) растворяют 0,01 г ортофенилендиамина и вносят 0,05 мл 33-36 -ной перекиси водорода. Планшет закрывают крышкой и инкубируют в темном месте при комнатной температуре (222 С) в течение 30 мин. Реакцию останавливают после развития желтого окрашивания в лунках с положительным контролем путем внесения в каждую лунку планшета по 0,1 мл 2 М раствора серной кислоты. Остановка реакции характеризуется темно-коричневым окрашиванием субстратной смеси в лунках с контрольной позитивной сывороткой. Результаты анализа учитывают, если средние значения оптической плотности (ОП) реакционной жидкости в лунках с контрольной отрицательней сывороткой, контролей конъюгата и субстрата не более 0,2 оптической единицы (о.е.), а в лунках с контрольной позитивной сывороткой не менее 0,8 о.е. Учет проводят путем измерения оптической плотности реакционной жидкости в лунках планшета на спектрофотометре( , ) при длине волны 492 нм. Результаты анализа сывороток крови крупного рогатого скота на бруцеллез считают положительными, если среднее значение ОП исследуемого образца сыворотки (Р) превышает среднее значение ОП контрольной отрицательной сывороткине менее 2,1 раза (/). Пример. Чувствительность предложенного способа оценивают в сравнении с общеизвестными способамии РСК, а также ИФА, в котором в качестве антигена используют цельные клетки 19. Результаты исследований образцов сыворотки крови 1041 головы показали наличие в них противобруцеллезных антител по РА РСК и ИФА с цельными клетками 19 соответственно у 27 (2,6 ), 22 (2,1 ) и 45 (4,3 ) голов,тогда как предлагаемый способ диагностировал бруцеллез у 60 (5,7 ) голов. При этом предлагаемый способ полностью подтвердил позитивные показания РА, РСК и ИФА с цельными клетками 19 и позволил дополнительно выявить 15 больных бруцеллезом животных, что свидетельствует о высокой чувствительности данного способа. Об эффективности предлагаемого способа ИФА свидетельствуют и показания оптической плотности исследуемых сывороток крови, что позволяет вести учет результатов анализа не только спектрофотометрический, но и визуально (таблица). 19230 Таблица Значения оптической плотности (ОП 492) сывороток крови крупного рогатого скота в ИФА при исследовании на бруцеллез Диапазоны значений ОП 492 сывороток крови 0,100-0,310 0,310-0,390 0,390-0,510 0,510-0,710 0,710-0,910 0,910-1,99 К(-) К С белками внешней мембраны 19 Примечание К(-) - контрольная отрицательная сыворотка К - контрольная позитивная сыворотка. Как видно из таблицы, значения оптической плотности исследуемых сывороток с белками внешней мембраны бруцелл заметно превосходили показания ОП, полученные при взаимодействии сывороток с корпускулярным антигеном 19. Так, например, из 60 животных, в сыворотках крови которых обнаружены антитела,специфичные к белкам внешней мембраны бруцелл,у 36 или 60 средние значения оптической плотности достоверно превышали аналогичные показания,полученные с корпускулярным антигеном 19 (соответственно 0,8370,041 против 0,7120,040 и 1,5220,09 против 1,0600,055). Предложенный способ является более чувствительным по сравнению с общепринятыми серологическими реакциями, а также ИФА, в котором в качестве антигена используется корпускулярный антиген из штамма 19. Использование предлагаемого способа в ветеринарной практике позволит повысить эффективность проводимых мероприятий за счет более полного выявления инфицированных бруцеллезом животных. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ определения антител против возбудителя бруцеллеза,включающий сенсибилизацию полистироловой планшеты инактивированным корпускулярным антигеном из штамма 19 с последующим выявлением антител в сыворотках крови с помощью ферментной метки,отличающийся тем, что для сенсибилизации полистироловой планшеты используют белки внешней мембраны 19, а наличие антител определяют с помощью меченных ферментом иммуноглобулинов против видового