Слитый белок, способ его получения, фармацевтическая композиция, способ стимулирования эритропоэза у млекопитающего и белок димерной структуры на его основе, молекула рекомбинантной днк и клеточная линия, включающая молекулы днк

(51) 12 15/62 (2011.01) 61 38/18 (2011.01) 61 47/42 (2011.01) 61 47/48 (2011.01) 61 7/00 (2011.01) 07 14/505 (2011.01) 07 16/18 (2011.01) 07 19/00 (2011.01) 12 15/13 (2011.01) 12 15/18 (2011.01) 12 21/02 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ КОМПОЗИЦИЯ,СПОСОБ СТИМУЛИРОВАНИЯ ЭРИТРОПОЭЗА У МЛЕКОПИТАЮЩЕГО И БЕЛОК ДИМЕРНОЙ СТРУКТУРЫ НА ЕГО ОСНОВЕ, МОЛЕКУЛА РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ МОЛЕКУЛЫ ДНК(57) Описан рекомбинантный слитый белок,включающий часть пептида человеческого эритропоэтина, связанную с частью пептида иммуноглобулина. Слитый белок имеет более длинныйпериод полураспада по сравнению с естественным или рекомбинантным естественным человеческим эритропоэтином. В одном варианте изобретения белок имеет период полураспада, по меньшей мере в три раза превышающий период полураспада естественного человеческого эритропоэтина. Слитый белок также показывает увеличенную гемопоэтическую биоактивность по сравнению с естественным человеческим эритропоэтином. В еще одном варианте изобретения слитый белок включает пептидную последовательность полной молекулы человеческого эритропоэтина (ЕРО) и пептидную последовательностьфрагмента человеческого иммуноглобулина .Фрагмент в слитом белке включает шарнирный участок, СН 2 и СН 3 домены человеческого иммуноглобулина . Молекула ЕРО может быть связана непосредственно сфрагментом, для исключения внешних линкерных пептидов и уменьшения риска иммуногенной реакции при введении. В еще одном варианте, шарнирный участок является вариантом человеческогофрагмента, имеющим остаток,(73) НОВАДЖЕН ХОЛДИНГ КОРПОРЭЙШН(74) Тагбергенова Алма Таишевна Тагбергенова Модангуль Маруповна Касабекова Найля Ертисовна отличный от цистеина, в аминокислоте в положении 6. Изобретение также относится к последовательностям нуклеиновых кислот и аминокислот, кодирующим слитый белок, и трансфектированным клеточным линиям и способам получения слитого белка. Изобретение далее относится к фармацевтическим композициям,включающим слитый белок, и способам применения слитого белка и/или фармацевтических композиций,например для стимулирования эритропоэза у млекопитающего, нуждающегося в лечении. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Слитый белок, имеющий более длительныйпериод полураспада по сравнению с естественным или рекомбинантным естественным человеческим эритропоэтином, включаюший а) молекулу естественного человеческого эритропоэтина, имеющую остаток цистеина вблизи ее -терминального конца и фрагмент молекулычеловека,включающий шарнирный участок, в котором терминальный конец указанного с фрагмента непосредственно связан с указанным Стерминальным концом указанной молекулы эритропоэтина, и в котором указанный с фрагмент является природным за исключением мутации в результате замены остатка цистеина указанного шарнирного участка, расположенного ближе к указанной молекуле эритропоэтина, отличным от цистеина остатком, где первый остаток цистеина указанного шарнирного участка, расположенный ближе к указанному -терминальному концу,отделен, по меньшей мере, 17 аминокислотами от указанного остатка цистеина указанной молекулы эритропоэтина. 2. Белок по п. 1, у которого период полураспада указанного белка, по меньшей мере, в три раза превышает период полураспада указанного естественного человеческого эритропоэтина. 3. Белок по п. 2, у которого указанный период полураспада указанного белка, по меньшей мере, в четыре раза превышает период полураспада указанного естественного человеческого эритропоэтина. 4. Слитый белок по п. 2, где указанный слитый белок имеет увеличенную эритропоэтическую биоактивность по сравнению с указанным естественным человеческим эритропоэтином. 5. Слитый белок по п. 1, в котором указанныйфрагмент является 1 фрагментом. 6. Слитый белок по п. 5, в котором указанный с фрагмент включает шарнирный участок и СН 2 и СН 3 домены. 7. Слитый белок по п. 1, где указанный белок имеет аминокислотную последовательность,представленную в 98-ую идентичность ей, и указанный белок имеет остаток, отличный от цистеина, в аминокислоте в остатке 172. 8. Слитый белок по п.7, где указанный белок имеет аминокислотную последовательность,представленную в . .2. 9. Белок димерной структуры, включающий два слитых белка по п. 1. 10. Димерный белок, включающий два полипептида,каждый из которых имеет аминокислотную последовательность,представленную в. 2,или последовательность, имеющую, по меньшей мере,98-ую идентичность ей. 11. Белок по п.10, в котором указанный димер содержит дисульфидные связи между соответствующими шарнирными участками указанных полипептидов. 12. Белок по п.10, в котором каждый из указанных полипептидов имеет молекулярную массу, равную приблизительно 75 кДа. 13. Белок по п. 10, в котором указанный димер имеет молекулярную массу, равную приблизительно 180 кДа. 14. Фармацевтическая композиция,отличающаяся тем, что включает белок по п.1,фармацевтически приемлемый носитель,вспомогательные вещества или разбавители. 15. Последовательность нуклеиновых кислот,которая кодирует полипептид, по меньшей мере, с 98-ой идентичностью аминокислотной последовательности в . . 2, где указанный полипептид имеет более длительныйпериод полураспада по сравнению с естественным человеческим эритропоэтином. 16. Молекула рекомбинантной ДНК,включающая последовательность нуклеиновых кислот, представленную в . . 1, или последовательность, имеющую, по меньшей мере,98-ую идентичность ей. 17. Клеточная линия, трансфектированная молекулой рекомбинантной ДНК по п. 16. 18. Клеточная линия по п. 17, где указанная клеточная линия является СНО клеточной линией. 19. Способ получения белка по п. 1,включающий культивирование клеточной линии, 25711 трансфектированной молекулой ДНК по п.16, и очистку полипептида, кодируемого ею. 20. Способ стимулирования эритропоэза у млекопитающего,отличающийся тем,что включает введение указанному млекопитающему белка по п. 1 и/или фармацевтической композиции по п. 14. 21. Способ по п.20, отличающийся тем, что указанное млекопитающее является приматом. 22. Способ по п.21, отличающийся тем, что указанный примат является человеком. 23. Способ по п.20, отличающийся тем, что введение белка осуществляют внутривенно или подкожно, и период полураспада указанного белка при введении указанному млекопитающему, по меньшей мере, в три раза превышает период полураспада естественного человеческого ЕРО. 24. Способ по п.23, отличающийся тем, что период полураспада указанного белка при введении указанному млекопитающему внутривенно или подкожно, по меньшей мере, в четыре раза превышает период полураспада естественного человеческого ЕРО. 25. Слитый белок по п.8, в котором указанный остаток,отличный от цистеина,является нейтральной аминокислотой. 26. Слитый белок по п.25, в котором указанный остаток, отличный от цистеина, является глицином. 27. Слитый белок по п. 1, в котором период полураспада указанного белка при введении млекопитающему, по меньшей мере, в три раза превышает период полураспада естественного человеческого эритропоэтина,введенного указанному млекопитающему тем же самым способом. 28. Слитый белок по п.27, в котором период полураспада указанного белка при введении млекопитающему, по меньшей мере, в четыре раза превышает период полураспада естественного человеческого эритропоэтина,введенного указанному млекопитающему тем же самым способом. 29. Слитый белок по п.27, в котором указанное млекопитающее является человеком. 30. Димер по п.9, в котором указанный шарнирный участок указанного первого слитого белка связан с указанным шарнирным участком указанного второго слитого белка дисульфидными связями. 31. Молекула рекомбинантной ДНК по п.16,включающая последовательность нуклеиновых кислот, представленную в . .1. 32. Димер по п.10, включающий два полипептида,каждый из которых имеет аминокислотную последовательность,представленную в . .2. 33. Слитый белок, имеющий более длительныйпериод полураспада по сравнению с естественным или рекомбинантным естественным человеческим эритропоэтином, включающий(а) часть пептида эритропоэтина, имеющую остаток цистеина вблизи его С-терминального конца и с фрагмент, включающий шарнирный участок, в котором -терминальный конец указанного с фрагмента непосредственно связан с С-терминальным концом указанной части пептида эритропоэтина и в котором указанный шарнирный участок имеет мутацию в положении аминокислоты вблизи указанного -терминального конца путем замены остатка цистеина на отличный от цистеина остаток, на котором первый остаток цистеина указанного шарнирного участка, расположенный ближе к указанному -терминальному концу,отделен, по меньшей мере, 12 аминокислотами от указанного остатка цистеина указанной части пептида эритропоэтина. 34. Слитый белок по п.33, в котором указанный шарнирный участок составляет, по меньшей мере, 9 аминокислот в длину. 35. Слитый белок по п.34, в котором указанный шарнирный участок является человеческим с фрагментом, имеющим остаток, отличный от цистеина, в аминокислоте в 6 положении,отсчитанном от -терминального конца указанного шарнирного участка. 36. Слитый белок по п.35, в котором указанный шарнирный участок имеет аминокислотную последовательность , или последовательность, имеющую, по меньшей мере,90-ую идентичность ей. 37. Слитый белок по п.33, в котором указанный белок содержит аминокислотную последовательность, представленную в . .2, или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 98-ую идентичность ей. 38. Слитый белок по п.33, в котором часть пептида эритропоэтина является полной молекулой человеческого эритропоэтина. 39. Слитый белок по п.33, в которомфрагмент являетсяфрагментом молекулычеловека,включающим указанный шарнирный участок и СН 2 и СН 3 домены. 40. Слитый белок по п. 39, в котором указанныйфрагмент молекулыявляется 1 фрагментом.