Способ диагностики ценуроза овец

(51) 01 33/569 (2006.01) 61 10/00 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к иммунодиагностике паразитозов, и может быть использовано для диагностики ларвального ценуроза овец. Способ диагностики ценуроза овец,включающий взятие крови у исследуемых овец,отделение сыворотки, постановку реакции непрямой иммунофлуоресценции, при этом в качестве антигена используют стабилизированный эритроцитарный диагностикум сенсибилизированный ценурозным антигеном, в качестве индикаторной системы антивидовая к иммуноглобулину овец меченная флуорохромом сыворотка. Способ диагностики ценуроза овец имеет следующие преимущества повышается чувствительность и достоверность исследования.(72) Сабаншиев Мажит Хусаинов Дамир Микдатович Бердикулов Максат Аманбекович Асылханов Дархан Уалиевич Усмангалиева Сымбат Суттибаевна Мауланов Амангельды Заманович Мухитдинова Гульнара Ергалиевна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Казахский национальный аграрный университет Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЦЕНУРОЗА ОВЕЦ Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к иммунодиагностике паразитозов, и может быть использовано для диагностики ларвального ценуроза овец. Известен способ диагностики ценуроза,включающий взятие крови, отделение сыворотки и е исследование в иммунологической реакции, при этом используют метод непрямой гемагглютинации. Способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при ценурозе,Предварительный патент РК 19188, Кл. 01 33/569, 14.03.2008 г Недостатком способа является недостаточная чувствительность реакции. Цель изобретения - разработка и внедрение в ветеринарную практику более эффективного способа диагностики ценуроза овец. Техническая сущность изобретения состоит в разработке более эффективного способа диагностики ценуроза овец. Это достигается тем, что в способе постановки реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) используют в качестве антигена стабилизированный эритроцитарный диагностикум,сенсибилизированный ценурозным антигеном, а в качестве индикаторной системы антивидовую к иммуноглобулину овцы меченную флуорохромом сыворотку. Пример осуществления этого способа. Реакцию ставят на обезжиренном предметном стекле. Для реакции необходимы следующие компоненты формалинизированные эритроциты барана,сенсибилизированные ценурозным антигеном, исследуемые сыворотки крови овец,положительные и отрицательные контрольные сыворотки овец, физиологический забуференный раствор, антивидовая к иммуноглобулину овец люминисцирующая сыворотка и люминисцентный микроскоп. Для изготовления сенсибилизированных эритроцитов барана зрелые членики цестоды, наполненные яйцами и содержащие онкосферы,получают от экспериментально зараженных собак. Членики разрушают механическим путем и отмывают яйца путем центрифугирования в физиологическом растворе поваренной соли при 1000 об/мин в течение 5 минут, дважды. Отмытые яйцапоследовательно подвергают обработке искусственным желудочным соком (0,35 соляной кислоты, 0,15 пепсина), а затем искусственным кишечным соком (5 едкого натрия, 0,1 панкреатина). При этом на каждые 100 тыс. яицрасходуют по 5 мл, обработку искусственным желудочным соком осуществляли в течение 1,5-2 ч, а кишечным соком 15-20 минут при температуре 37-38 С. После обработки желудочным соком яйцаотмывают путем центрифугирования при 1000 об/мин в течение 5 минут в физиологическом растворе натрия хлорида, а после обработки кишечным соком,освободившиеся онкосферы средой культивирования. 2 Отмытые онкосферы помещают в среду культивирования, из расчета на 100 тыс. онкосфер 40-50 см 3, в которой происходит культивирование в течение 48-50 часов при температуре 37-38 С. Среду культивирования готовят из следующих ингредиентов, мл нативная сыворотка 2-3 месячных телят, 50 см 3 (10) бензилпенициллина калиевая соль 0,15 см 3 (0,5 г сухого вещества разводят в 10 см 3 среды 199) - 0,03 стрептомицина сульфат 0,1 см 3 (0,5 г сухого вещества разводят в 10 см 3 среды 199) - 0,02 и среда 199 - остальное до 500 см 3. По истечении срока культивирования онкосферы превращаются в проценурусы, количество которых доводят до 2000100 экземпляров в 1 см 3 среды. С целью усиления антигенных свойств проценурусы подвергают обработке ультразвуком при 20-24 кГц в течение 10-15 минут. Устанавливают 8,0-9,0 и подвергают ультразвуковой лизат автоклавированию при 1 атмосфере (120 С) в течение 20-30 мин., затем остужают до температуры 18-25 С и подвергают центрифугированию при 8-10 тыс. оборотов в минуту. Полученный лизат(сенситан) используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов. Предварительно до сенсибилизации формалинизированные эритроциты обрабатываются детергентом - додецилсульфатом натрия в 1-ной концентрации при температуре 50-60 С в течение 30 мин. Сенсибилизация формалинизированных эритроцитов после обработки додецилсульфатом натрия проводится оптимальной дозой сенситина,которая определяется путем титрации его с использованием стандартного образца противоценурозной сыворотки. Специфичность и активность готового эритроцитарного антигена проверяются путем исследования в НРИФ отрицательной сыворотки и стандартного образца противоценурозной с сыворотки. Пример определения оптимальных условий обработки формалинизированных эритроцитов додецилсульфатом натрия и сенсибилизации их сенситином (липополисахаридобелковый комплекс). Определение оптимальной концентрации додецилсульфата натрия, требуемой для повышения адсорбционных свойств эритроцитов и получения специфичного и активного эритроцитарного антигена для НРИФ, проводится путем обработки 10 взвеси формалинизированных эритроцитов разными концентрациями(1,0 1,5,) додецилсульфата натрия и проверки активности и специфичности в НРИФ антигена, полученного путем сенсибилизации эритроцитов, обработанных разными концентрациями указанного детергента. Оптимальную сенсибилизирующую дозу сенситина,необходимую для получения стандартного антигена для РНИФ с оптимальной активностью, определяют путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов(предварительно обработанных додецилсульфатом натрия) возрастающими дозами сенситина и проверки серологической активности сенсибилизированных эритроцитов (антигена) в НРИФ с использованием стандартного образца противоценурозной сыворотки. Для сенсибилизации эритроцитов к 1 см 3 5-ной их взвеси добавляют по 0,5 1,0 1,5 2,0 см 3 сенситина. Антиген, изготовленный путем сенсибилизации эритроцитов, не обработанных додецилсульфатом натрия, обладает низкой активностью. Обработка эритроцитов додецилсульфатом натрия повышает активность эритроцитарного антигена. Наиболее оптимальной для обработки эритроцитов является 1-ная концентрация додецилсульфата натрия,позволяющая получить эритроцитарный антиген,обладающий достаточно высокой активностью и не дающий неспецифические реакции с негативной сывороткой и физраствором. Наименьшей дозой сенситина, позволяющей получить антиген с достаточно высокой активностью, является 1,01,5 см 3 его на 1 см 3 5-ной взвеси формалинизированных эритроцитов,предварительно обработанных детергентом. Следовательно, обработка эритроцитов 1,0-ной концентрацией додецилсульфата натрия и сенсибилизация их, из расчета 1-1,5 см 3 сенситина на 1 мл 5-ной взвеси эритроцитов, позволяет получить специфичный и активный ценурозный эритроцитарный антиген для непрямой реакции иммунофлуоресценции (НРИФ). Для постановки реакции на предметном стекле готовят тонкие мазки из сенсибилизированных антигеном эритроцитов. Мазки высушивают на воздухе и фиксируют охлажденным ацетоном(-5-8 С ) в течении 10 секунд. Каждый мазок делят восковым карандашом на 6-8 зон, в которые наносят по 1-2 капли в разные зоны из сывороток(испытуемые и контрольные) в разведении 12 и 15. Далее, мазки с сыворотками инкубируют во влажной камере 30-40 минут при 37-38 С, затем промывают их забуференным физиологическим раствором. Мазки высушивают на воздухе и наносят по 1-2 капли антивидовую к иммуноглобулину овец меченной сыворотки в рабочем разведении и снова их помещают в термостат для инкубирования. По истечении 30-40 минут мазки снова промывают забуференным физиологическим раствором,высушивают и просматривают под люминисцентным микроскопом под иммерсией. Обычно наблюдают следующую картину при отрицательном результате эритроциты светятся тусклым сероватым цветом, или светящихся эритроцитов нет. В препаратах, с положительной реакцией,наблюдается желто-зеленое периферическое свечение эритроцитов. Интенсивность свечения оценивают в крестах 4 - яркая, светящаяся желто-зеленая периферическая люминесценция эритроцитов 3 - отчетливо выраженная достаточно яркая желто-зеленая периферическая люминесценция эритроцитов 2 - неяркая периферическая люминесценция эритроцитов желтого цвета 1 - слабая периферическая люминесценция эритроцитов желто-серого цвета- - отсутствие специфической люминесценции. Контролем служит заведомо отрицательная и положительная противоценурозная сыворотка овец. Способ диагностики ценуроза овец имеет следующие преимущества повышается чувствительность и достоверность исследования. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики ценуроза овец, включающий взятие крови, отделение сыворотки и е исследование в иммунологической реакции,отличающийся тем, что осуществляют постановку реакции непрямой иммунофлуоресценции, при этом в качестве антигена используют стабилизированный эритроцитарный диагностикум сенсибилизированный ценурозным антигеном, а в качестве индикаторной системы антивидовые к иммуноглобулину овец меченные флуорохромом сыворотки, для постановки реакции на предметном стекле готовят тонкие мазки из сенсибилизированных антигеном эритроцитов,мазки высушивают на воздухе и фиксируют охлажденным ацетоном (-5-8 С) в течении 10 секунд, каждый мазок делят восковым карандашом на 6-8 зон, в которые наносят по 1-2 капли в разные зоны из сывороток овец (испытуемые и контрольные) в разведении 12 и 15, далее, мазки с сыворотками инкубируют во влажной камере 30-40 минут при 37-38 С, затем промывают их забуференным физиологическим раствором, мазки высушивают на воздухе и наносят по 1-2 капли антивидовой к иммуноглобулину овец меченной сыворотки в рабочем разведении, снова их помещают в термостат для инкубирования, по истечении 30-40 минут мазки промывают забуференным физиологическим раствором,высушивают и просматривают под люминисцентным микроскопом под иммерсией.