Способ получения антигена для роз-бенгал пробы при диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных

(51) 61 39/10 (2006.01) 61 10/00 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ сельскохозяйственных животных, включающий выращивание бруцелл на питательной среде с последующим их смывом,отмывание,суспендирование, инактивирование, окрашивание и ресуспендирование в буферном разбавителе, в качестве бактериальной культуры используют штаммы бактерий 19 и-1, содержащие в своем составе формы бруцелл, которые выращивают на твердой питательной среде, смывают, после чего отмывают и суспендируют в физиологическом растворе,полученную суспензию инактивируют при 70 С в течение 1 ч, после чего инактивированные суспензии двух штаммов смешивают в соотношении 11 и окрашивают 0,25-ным водным раствором краски розовой бенгальской путем смешивания микробной суспензии с раствором краски в соотношении 51, выдерживают смеси в течение 2 ч при постоянном встряхивании, затем окрашенную взвесь промывают физиологическим раствором трехкратно, центрифугируют при 5500 об/мин в течение 20 мин, полученную надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 0,5 фенолизированном физиологическом растворе до концентрации 8 и доводятдо 3,65 с помощью молочной кислоты.(72) Барамова Шолпан Аузаровна Султанов Ахметжан Акиевич Мырзалиев Ахан Жакангерович Оспанов Ержан Калиолдинович Шманова Балымзия Тастановна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ РОЗ-БЕНГАЛ ПРОБЫ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ БРУЦЕЛЛЕЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, может быть использовано при изготовлении препаратов для серологической диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Технический результат,обеспечиваемый изобретением выражается в получении высокоактивного антигена для роз-бенгал пробы при диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Способ получения антигена для роз-бенгал пробы при диагностике бруцеллеза Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, может быть использовано при изготовлении препаратов для серологической диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Известен способ получения цветного антигена для роз-бенгал пробы при диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных, включающий выращивание бруцелл на питательной среде с последующим их смывом,отмывание,суспендирование, инактивирование, окрашивание и ресуспендирование в буферном разбавителе Предварительный патент Республики Казахстан 14639, кл. А 61 39/10, 2004. Недостатком данного цветного антигена является относительно невысокая диагностическая активность. Задачей изобретения является получение высокоактивного антигена для постановки розбенгал пробы и повышение чувствительности способа при диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Технический результат,обеспечиваемый изобретением выражается в получении высокоактивного антигена для роз-бенгал пробы при диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Способ получения антигена для роз-бенгал пробы при диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных, включающий выращивание бруцелл на питательной среде с последующим их смывом,отмывание, суспендирование, инактивирование,окрашивание и ресуспендирование в буферном разбавителе, в качестве бактериальной культуры используют штаммы бактерий 19 и-1, содержащие в своем составе - формы бруцелл, которые выращивают на твердой питательной среде, смывают, после чего отмывают и суспендируют в физиологическом растворе, полученную суспензию инактивируют при 70 С в течение 1 ч, после чего инактивированные суспензии двух штаммов смешивают в соотношении 11 и окрашивают 0,25-ным водным раствором краски розовой бенгальской путем смешивания микробной суспензии с раствором краски в соотношении 51, выдерживают смеси в течение 2 ч при постоянном встряхивании, затем окрашенную взвесь промывают физиологическим раствором трехкратно, центрифугируют при 5500 об/мин в течение 20 мин, полученную надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 0,5 фенолизированном физиологическом растворе до концентрации 8 и доводятдо 3,65 с помощью молочной кислоты. В способе используют штамм бактерий 19 и-1,депонированные в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(КазНИВИ). Способ получения антигена для роз-бенгал пробы(РБП) при диагностике бруцеллеза 2 сельскохозяйственных животных состоит в следующем. Пример 1. Культуры бактерий 19,-1 выращивают на твердой питательной среде в течение 3 сут с последующим их смывом 0,5 фенолизированным раствором, полученную бактериальную массу концентрируют путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение 30 мин, фильтруют через двойной марлевый фильтр в колбы и прогревают в водяной бане при температуре 70 С в течение 1 ч при постоянном помешивании. Затем полученные взвеси бруцелл проверяют на чистоту и стерильность путем высева на питательные среды. Инактивированные суспензии смешивают в соотношении 11. Полученные суспензии центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин,надосадочную жидкость удаляют, а осадок доводят физиологическим раствором до 200 млрд. микробных клеток в 1,0 см 3. Полученную микробную суспензию окрашивают 0,25-ным водным раствором краски розовой бенгальской путем смешивания микробной суспензии с раствором краски в соотношении 51. Смесь выдерживают в течение 2 ч при постоянном встряхивании. Затем окрашенные клетки бруцелл промывают физиологическим раствором трехкратно,путем центирифугирования при 5500 об/мин в течение 20 мин, а надосадок удаляют. Полученный осадок ресуспендируют 0,5 фенолизированным физиологическим раствором до концентрации 8, доводят до 3,65 с помощью молочной кислоты. Пример 2. РБП с антигеном применяют для исследования сывороток крови при диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Реакцию проводят на чистых белых сухих эмалированных пластинках с лунками при температуре 18-30 С. В лунку пластинки наносят 0,03 см 3 антигена,рядом наносят 0,03 см 3 исследуемые пробы. Сыворотки смешивают антигенам с сухой стеклянной палочкой до получения однородной смеси, распределяя при этом, по всей поверхности лунки. Пластику покачивают в течение 4 минут осторожным вращательными движениями, по истечении которых проводят визуальный учет результатов реакции. При положительной реакции в течение 4 мин появляются мелкие хлопья агглютината, в виде кольца по краю лунки. Реакцию считают отрицательной при отсутствии агглютинации (смесь гомогенна, равномерно окрашена). В начале работы одновременно с испытуемыми пробами ставят контроли с негативными и позитивными сыворотками. Пример 3. Эффективность и чувствительность РБП с разработанным антигеном изучена при исследовании сывороток крови и молока 131 голов коров из различных по эпизоотическому состоянию по бруцеллезу хозяйств (село Ават и село Ащисай с/о Каратурук Енбекшиказахского района Алматинской области). Для сравнения использовали коммерчески роз-бенгал антиген, изготовленный по существующей методике. Для подтверждения полученных результатов также ставили РА, РДСК и КР с молоком. Результаты исследований представлены в таблице 1. Из данных таблицы 1 видно, сывороток крови и молока от 109 коров, находящихся в благополучных хозяйствах по бруцеллезу,отрицательно реагировали по всем тестам, что свидетельствует о специфичности реакции. Из 22 исследуемых проб крови коров в РБП с испытуемым антигеном положительно реагировали 5 проб,а с биофабричными бруцеллезными антигенами в РБП 5, РДСК-6 и в РА-4. При сравнительном изучении показаний вышеперечисленных реакций установлена высокая эффективность и специфичность РБП с разработанным антигеном при исследовании сывороток крови на бруцеллез. Использование способа получения антигена для РБП при диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных позволяет значительно повысить результативность серологических исследований животных. Таблица 1 Результаты серологических исследований молока и сывороток крови коров на бруцеллез Вид жив. Село Ащисай с/о Каратурук Енбекшиказахского р/на Алмат. обл. Село Ават Енбекшиказахского р/на Алмат. обл. Всего Кол-во РБП с Биофабричные антигены гол. испытуемым КР с РБП РА РДСК антигеном молоком 109 0/109 0/109 0/109 0/10 0/109 9 Примечание числитель - положительно реагирующие знаменатель - отрицательно реагирующие. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигена для роз-бенгал пробы при диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных, включающий выращивание бруцелл на питательной среде с последующим их смывом,отмывание,суспендирование, инактивирование, окрашивание и ресуспендирование в буферном разбавителе,отличающийся тем, что в качестве бактериальной культуры используют штаммы бактерий 19 и-1,содержащие в своем составе - формы бруцелл,которые выращивают на твердой питательной среде,смывают, после чего отмывают и суспендируют в физиологическом растворе, полученную суспензию инактивируют при 70 С в течение 1 ч, после чего инактивированные суспензии двух штаммов смешивают в соотношении 11 и окрашивают 0,25 ным водным раствором краски розовой бенгальской путем смешивания микробной суспензии с раствором краски в соотношении 51, выдерживают смеси в течение 2 ч при постоянном встряхивании,затем окрашенную взвесь промывают физиологическим раствором трехкратно,центрифугируют при 5500 об/мин в течение 20 мин,полученную надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 0,5 фенолизированном физиологическом растворе до концентрации 8 и доводятдо 3,65 с помощью молочной кислоты.