Способ диагностики предрасположенности к раку молочной железы в казахской этнической группе женщин Казахстана на основе использования полиморфизма rs 17542768 гена FGFR2

(51) 12 1/68 (2006.01) 01 33/48 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ определения вероятности возникновения и развития люминального типа РМЖ среди женщин казахской национальности, проживающих в РК, качественно повышающего достоверность диагноза. Решение поставленной задачи достигается тем, что в качестве маркера предрасположенности и риска развития РМЖ предлагается детекция однонуклеотидного 17542768 полиморфизма гена 2,определяемого с использованием варианта полимеразной цепной реакции анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов(ПЦР-ПДРФ). В процессе амплификации изучаемого участка образуется фрагмент размером 206 пар нуклеотидов (пн). Замена нуклеотида А нав локусе 17542768 гена 2 образует сайт рестрикции для эндонуклеазы 8, которая разрезает амплифицированный продукт на два фрагмента 159 пн и 47 пн. Способ диагностики основан на том, что аллель А является маркером повышения риска (рисковый аллель) развития РМЖ люминального типа (//-2/-) в казахской этнической группе женщин Казахстана. Основным преимуществом предлагаемого метода является возможность проведения ранней доклинической и предиктивной диагностики рака молочной железы на геномном уровне, а также определения предрасположенности к развитию заболевания среди женщин казахской национальности, проживающих в Казахстане.(72) Нигматова Виктория Геннадьевна Неупокоева Алена Сергеевна Рахымгожин Мади Бейсенгазиевич Хансеитова Александра Кабуловна Балмуханов Тимур Симович Айтхожина Нагима Абеновна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАКУ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В КАЗАХСКОЙ ЭТНИЧЕСКОЙ ГРУППЕ ЖЕНЩИН КАЗАХСТАНА НА ОСНОВЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА 17542768 ГЕНА 2(57) Изобретение относится к области молекулярной биологии, основной сферой его применения является молекулярная генетика и медицина. Задачей предлагаемого изобретения является разработка высокоточного, оперативного способа Изобретение относится к области молекулярной биологии, основной сферой его применения является молекулярная генетика и медицина. Изучение генов-кандидатов,являющихся маркрами онкологических заболеваний является перспективным направлением современной медицинской генетики, позволяющим не только повышать достоверность диагноза, основанного на традиционных показателях, но и определять риск возникновения данного заболевания до проявления клинических признаков. РМЖ представляет собой комплексное мультифакторное ген опосредованное заболевание,которое возникает и развивается в результате сложного взаимодействия генетических, геномных факторов и факторов окружающей среды. По данным главного онколога г. Алматы Д.Р. Кайдаровой смертность от РМЖ занимает третье место среди злокачественных заболеваний в Казахстане и ежегодно в Казахстане выявляется до 4 тыс. случаев рака молочной железы, около 1,5 тыс женщин умирают от этого заболевания Кайдарова Д.,Материалы международной конференции , 9-10 октября, 2014,Алматы. Известны способы диагностики онкологических заболеваний на основе определения ассоциаций полиморфизма участков генов, ассоциированных с заболеванием и развитием данного онкозаболевания. Проводятся полногеномные ассоциативные исследования) маркеров с риском развития РМЖ. Такисследования проведенные на материале европейских популяций обнаружили ассоциацию 2981582 варианта второго интрона гена 2 с РМЖ,.А.,., ,.,. . 2007. .44.7108771093. В популяции китаянок Хан рисковой генотип принадлежал маркеру 3750817 гена 2,М,,,,, ,,.2 (2). . 2012. .64. 71-76, а в популяции женщин Тайваня 13387042,Но ,,,,235,324, 17232.. 2012. . 32(2).475-482. Также показано, что высоко рисковые аллели гена 2, как правило, тесно ассоциированы с эстроген позитивнымиопухолями - М.,Р.,Н., ... 2008. .25. .4. . 1-10. Исследования, приведенные выше, выполнены среди представителей различных расовых и 2 этнических групп. Исследования, описывающие связь 17542768 полиморфизма 2 интрона гена 2 с РМЖ в качестве генетического маркера в этнических группах Казахстана, ранее не проводились. Задачей предлагаемого изобретения является разработка высокоточного, оперативного способа диагностики и определения риска возникновения РМЖ с учетом гормонального статуса опухоли среди женщин казахской национальности,проживающих в РК, качественно повышающего достоверность диагноза. Изобретение разработано на основе использования метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), а именно анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). В качестве объекта исследования использованы образцы крови, полученные в Казахском научноисследовательском Институте онкологии и радиологии и Городском онкологическом диспансере г. Алматы от женщин, больных РМЖ. У пациентов проводили определение гормонального статуса опухоли, определяли рецепторы эстрогенов-2/ иммуногистохимическим методом (ИГХ). При спорном результате ИГХ анализа -2/ проводили . В качестве контрольной группы использованы образцы крови практически здоровых женщин, полученные в Городском центре крови, г.Алматы. Забор образцов крови проводился на условиях добровольности,анонимности,подтвержденных собственноручными подписями,полученными в процессе анкетирования. Для дальнейшего анализа из группы пациентов РМЖ были отобраны образцы,которые соответствовали люминальному типу опухоли ( -2/-). Из группы здоровых были подобраны доноры, соответствующие по возрасту и национальности пациентам РМЖ (метод ). К остальным образцам пациентов была сформирована контрольная группа,соответствующая по возрасту и национальности. Решение поставленной задачи достигается тем,что в качестве маркеров предрасположенности и риска развития люминального типа РМЖ предлагается детекция однонуклеотидного полиморфизма 17542768 гена 2,определяемого с использованием варианта ПЦРПДРФ. В процессе амплификации изучаемого участка образуется фрагмент размером 206 пар нуклеотидов (пн). Замена нуклеотида А нав локусе 17542768 гена 2 образует сайт рестрикции для эндонуклеазы 8, которая разрезает амплифицированный продукт на два фрагмента 159 пн и 47 пн. Способ диагностики основан на том, что частота аллеля А среди пациенток казахской национальности с люминальным типом рака (, , -2/-),согласно полученным результатам, статистически достоверно отличается от частоты встречаемости в контрольной группе (рисковый аллель) (р 0.04), что предоставляет возможность рассматривать его в качестве маркера риска развития РМЖ люминального типа в казахской этнической группе. Пример 1 ДНК выделяется из ядер лейкоцитов периферической крови с использованием набора производства фирмы , США. Реакционная смесь при тестировании исследуемых полиморфизмов включает в себя следующие компоненты 60 мМ Трис-НС 1 ( 8,5) 1,5 мМ 2 25 С 10 М 2-меркаптоэтанол, 0,1 Тритон Х-100 по 2 пМ каждого из праймеров и смесь(, , , ) п 0,2 мМ каждого, -ДНК полимераза (1 ед/мкл) и 50 нг ДНК образца. Амплификация полиморфных фрагментов проводится в следующем температурновременном режиме 1 цикл при 95 С - 3 мин., 36 циклов 95 С - 30 сек., 60 С - 40 сек., 72 С - 30 сек.,финальная элонгация 72 С - 5 мин. Используются следующие олигонуклеотидные праймеры 53 - прямой и 5- -3 - обратный. Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР проводят в 8 полиакриламидном геле при силе тока 100 мА в течение 2-3 часов. Наличие аллеля А в тестируемом участке гена 2 ассоциировано с генетической предрасположенностью к раку молочной железы люминального типа (, , -2/-) в казахской этнической группе. Пример 2. Возможность осуществления изобретения подтверждена Казахским научноисследовательским Институтом онкологии и радиологии МЗ РК при проведении тестирования изучаемого полиморфизма среди женщин казахской национальности с клинически подтвержденным диагнозом - рак молочной железы люминального типа. Верхняя полоса - фрагмент размером 206 пн (А аллель), две нижних полосы - 159 и 47 пн(образуются в результате рестрикции -аллель),АА генотип 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13 дорожкигенотип 1, 2, 4, 8 дорожки М- маркер молекулярной массы. Фиг.1. Продукты амплификации и рестрикции фрагмента гена 2. В качестве примера 2 на фиг.1 приведены результаты тестирования образцов ДНК, при котором определяются генотипы АА,в исследуемом фрагменте гена 2, образующиеся в результате амплификации и последующей рестрикции изучаемого полиморфного участка. Основным преимуществом предлагаемого метода является возможность проведения на геномном уровне методом ПЦР-ПДРФ ранней доклинической и предиктивной диагностики рака молочной железы среди женщин казахской национальности, проживающих в Казахстане. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики предрасположенности к раку молочной железы в казахской этнической группе женщин Казахстана,включающий исследование ДНК методом ПДРФ, отличающийся тем,что в качестве маркера наличия предрасположенности к люминальному типу рака молочной железы используют детекцию однонуклеотидного полиморфизма 17542768 гена 2 и,при обнаружении аллеля А,диагностируют повышенную вероятность риска развития люминального типа рака молочной железы в казахской этнической группе женщин Казахстана.