Способ диагностики предрасположенности к раку молочной железы в русской этнической группе женщин Казахстана на основе использования полиморфизма rs 13181 гена XPD

(51) 12 1/68 (2006.01) 01 33/48 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ РМЖ среди женщин русской национальности,проживающих в РК, качественно повышающего достоверность диагноза. Решение поставленной задачи достигается тем, что в качестве маркера предрасположенности и риска развития РМЖ предлагается детекция однонуклеотидного полиморфизма 3181 гена , определяемого с использованием варианта полимеразной цепной реакции анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ). В процессе амплификации изучаемого участка образуется фрагмент размером 324 пн, содержащий сайт рестрикции для эндонуклеазы,формирующей два фрагмента размерами 100 и 224 пн, которые соответствуют генотипу ТТ. Во фрагменте 224 пн при отсутствии замены основанияна Т образуется второй сайт рестрикции для рестриктазы , после обработки которой образуются продукты 158, 100 и 66 пн,соответствующие генотипу. Способ диагностики основан на том, что аллель Т и соответствующий генотип ТТ являются маркером повышения риска развития РМЖ в русской этнической группе женщин Казахстана. Основным преимуществом предлагаемого метода является возможность проведения ранней доклинической и предиктивной диагностики рака молочной железы на геномном уровне, а также определения предрасположенности к развитию заболевания среди женщин русской национальности, проживающих в Казахстане.(72) Неупокоева Алена Сергеевна Шертай Малика Жаркинбековна Попова Ирина Викторовна Нигматова Виктория Геннадьевна Хансеитова Александра Кабуловна Балмуханов Тимур Саимович Айтхожина Нагима Абеновна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАКУ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В РУССКОЙ ЭТНИЧЕСКОЙ ГРУППЕ ЖЕНЩИН КАЗАХСТАНА НА ОСНОВЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА 13181 ГЕНА(57) Изобретение относится к области молекулярной биологии, основной сферой его применения является молекулярная генетика и медицина. Задачей предлагаемого изобретения является разработка высокоточного, оперативного способа определения вероятности возникновения и развития Изобретение относится к области молекулярной биологии, основной сферой его применения является молекулярная генетика и медицина. Изучение генов-кандидатов,являющихся маркрами онкологических заболеваний является перспективным направлением современной медицинской генетики, позволяющим не только повышать достоверность диагноза, основанного на традиционных показателях, но и определять риск возникновения данного заболевания до проявления клинических признаков. Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее распространенным из онкологических заболеваний у женщин, в развитие которого значительный вклад вносит генетическая составляющая. В последние десятилетия РМЖ занимает первое место среди онкологических заболеваний женщин в Республике Казахстан, а в 2011 году вышел на первое место среди популяционной онкологической заболеваемости населения Казахстана. Кайдарова Д.,Материалы международной конференции , 9-10 октября, 2014,Алматы. Известны способы диагностики онкологических заболеваний на основе определения ассоциаций полиморфизма участков генов, ассоциированных с заболеванием и развитием данного онкозаболевания, включая определенные участки генав качестве прогностического маркера. В мировых популяциях описаны ассоциации полиморфизмов в генес раком легкого Ни , ,,Н- //. - 2004, - . 46(1). - . 1-10, мочевого пузыря.,М.,. Н .,.//. - 2007. - .177. - . 3036, раке головы и шеиЕ.М.,.,.. /2-// .2000. - .21(12). - . 2219 - 2223. Ассоциации повышенного риска РМЖ с генотипом / локуса 13181 генаобнаружена среди женщин индийской популяцииМ.,,.,..751// . . - 2011.- . 2(1). . 155-159. Исследования, приведенные выше, выполнены среди представителей различных этнических групп. Однако, использование данных о наличии ассоциации ОНП с генопосредованными заболеваниями для одной популяции в применении к другой является неправомочным в связи с тем, что имеются достаточно большие межпопуляционные различия Степанов В.А. Геномы, популяции,болезни этническая геномика и персонифицированная медицина //.2010. - Т. 2.- 4 (7). - с.18-34. Поэтому проведение поиска генов-кандидатов, являющихся маркерами онкологических заболеваний для основных популяций Казахстана, является целесообразным. Исследования, описывающие связь 13181 гена 2 с РМЖ в качестве генетического маркера в этнических группах Казахстана, ранее не проводились. Задачей предлагаемого изобретения является разработка высокоточного, оперативного способа диагностики и определения риска возникновения РМЖ среди русских женщин, проживающих в РК,качественно повышающего достоверность диагноза. Изобретение разработано на основе использования метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), а именно анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). В качестве объекта исследования использованы образцы крови, полученные в Казахском научноисследовательском Институте онкологии и радиологии и Городском онкологическом диспансере г. Алматы от женщин, больных РМЖ. В качестве контрольной группы использованы образцы крови практически здоровых женщин,полученные в Городском центре крови, г. Алматы. Исследование проведено с соблюдением анонимности, информированности и добровольного участия женщин, подтвержденного письменно в процессе анкетирования. Решение поставленной задачи достигается тем,что в качестве маркеров предрасположенности и риска развития РМЖ предлагается детекция однонуклеотидного полиморфизма 13181 гена, определяемого с использованием варианта ПЦР-ПДРФ. В результате амплификации образуется фрагмент ДНК размером 324 пн, содержащий сайт рестрикции для эндонуклеазы , формирующей два фрагмента размерами 100 и 224 пн, которые соответствуют генотипу ТТ. Во фрагменте 224 пн при отсутствии замены основанияна Т образуется второй сайт рестрикции для рестриктазы , после обработки которой образуются продукты 158, 100 и 66 пн, соответствующие генотипу . Способ диагностики основан на том, что частота аллеля Т среди пациенток русской национальности, согласно полученным результатам, статистически достоверно отличается от частоты встречаемости в контрольной группе (рисковый аллель) (р 0.002, ,5 95 1,16-1,93). Анализ распределения генотипов среди русских женщин больных РМЖ также выявляет статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой (0.005, ,53 95 1,07-2,19 для генотипа ТТ). Вышеизложенные результаты предоставляют возможность рассматривать аллель Т и соответствующий генотип ТТ в качестве маркера риска развития РМЖ в русской этнической группе. Пример 1 ДНК выделяется из ядер лейкоцитов периферической крови с использованием набора производства фирмы , США. Реакционная смесь при тестировании исследуемых полиморфизмов включает в себя следующие компоненты 60 мМ Трис-НС 1 ( 8,5) 1,5 мМ 2 25 М С 1 10 М 2-меркаптоэтанол, 0,1 Тритон Х-100 по 2 пМ каждого из праймеров и смесь(, , , ) п 0,2 мМ каждого, -ДНК полимераза (1 ед/мкл) и 50 нг ДНК образца. Амплификация полиморфных фрагментов проводится в следующем температурновременном режиме 1 цикл при 96 С - 1 мин., 30 циклов 94 С - 30 сек., 60 С - 30 сек., 72 С - 1 мин.,финальная элонгация 72 С - 2 мин. Используются следующие олигонуклеотидные праймеры 53 - прямой 53 обратный. Электрофорез проводят в 8 полиакриламидном геле (ПААГ) при средних силе тока 60 мА и напряжении 300 В в течение 2-3 часов. Наличие аллеля Т и, соответственно, генотипа ТТ в тестируемом участке генаассоциировано с генетической предрасположенностью к раку молочной железы в русской этнической группе. Пример 2. Фиг.1. Продукты амплификации и рестрикции фрагмента гена ХР. Возможность осуществления изобретения подтверждена Казахским научноисследовательским Институтом онкологии и радиологии МЗ РК при проведении тестирования изучаемого полиморфизма среди женщин русской национальности с клинически подтвержденным диагнозом - рак молочной железы. В качестве примера 2 на фиг.1 приведены результаты тестирования образцов ДНК, при котором определяются генотипы ТТ, ,в исследуемом фрагменте гена , образующиеся в результате амплификации и последующей рестрикции изучаемого полиморфного участка. Основным преимуществом предлагаемого метода является возможность проведения на геномном уровне методом ПЦР-ПДРФ ранней доклинической и предиктивной диагностики рака молочной железы среди женщин русской национальности, проживающих в Казахстане. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики предрасположенности к раку молочной железы в русской этнической группе женщин Казахстана, включающий исследование ДНК методом ПДРФ, отличающийся тем, что в качестве маркера наличия предрасположенности к раку молочной железы используют детекцию однонуклеотидного полиморфизма 13181 гена, и, при обнаружении аллеля Т и генотипа ТТ,диагностируют повышенную вероятность риска развития рака молочной железы в русской этнической группе женщин Казахстана.