Способ получения имунной чумной сыворотки

(51) 61 35/16 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) 61 10/00 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ применение в биотехнологии для производства высокоактивных, специфичных диагностических сывороток. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в повышении активности и специфичности иммунной чумной сыворотки. Способ получения иммунной чумной сыворотки,включающий парентеральную иммунизацию кроликов антигеном, с последующим забором у них крови и отделением сыворотки, донорам-кроликам вводят внутривенно в качестве иммунизирующего агента фракцию 1, полученную из авирулентного штамма бактерииВ-195 в дозе 0,2 мг 0,25 мг 0,3 мг 0,35 мг 0,4 мг в 1,0 см 3 0,85-ого раствора хлорида натрия с 4-х дневным интервалом,с одновременным внутримышечным введением в качестве иммуностимулятора полиоксидония в дозе 0,25 мг в 0,5 см 3 0,85-ого раствора хлорида натрия, затем через 7 дней после последней иммунизации, после проверки титров антител, и при получении титров антител в РНГА 1100000 и выше,проводят полное кровопускание и получают целевой продукт.(72) Закарян Саркис Багратович Тугамбаев Тлеули Идрисович Атшабар Баыт Бахиялы Ковалева Галина Геннадиевна Окулова Ирина Владимировна Ли Елена Евгеньевна Абдирасилова Айгуль Акзамовна Рябушко Елена Александровна Баймурзинов Берик Базарович(73) Республиканское государственное казнное предприятие Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций им. Масгута Айкимбаева Агентства Республики Казахстан по защите прав потребителей(56) Тюменцева И.С. Научно-методические основы конструирования и усовершенствования производства диагностических тест-систем для выявления возбудителей особо опасных и других инфекций. Саратов, 1996, с.45(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИМУННОЙ ЧУМНОЙ СЫВОРОТКИ(57) Изобретение относиться к области биотехнологии в частности получению иммунных диагностических сывороток и может найти широкое Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению иммунных диагностических сывороток и может найти широкое применение в производстве высокоактивных,специфичных сывороток при снижении трудоемкости и отхода животных-продуцентов. Известен способ получения иммунной чумной сыворотки,включающий парентеральную иммунизацию кроликов антигеном, с последующим забором у них крови и отделением сыворотки Тюменцева И.С. Научно-методические основы конструирования и усовершенствования производства диагностических тест-систем для выявления возбудителей особо опасных и других инфекций. Автореферат дисс. на соискание уч. ст. доктора мед. наук, Саратов, 1996. с.45. Недостатком известного способа является недостаточная активность получаемых сывороток,трудоемкость процесса их получения, низком выходе целевого продукта, обусловленном высоким отходом животных продуцентов,что не обеспечивает возможности организации массового производства диагностических препаратов. Задачей изобретения является создание способа получения высокоактивной специфичной чумной сыворотки для диагностики чумы, а также приготовления чумных диагностических препаратов. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в повышении специфической активности чумной иммунной сыворотки, снижении трудозатрат на получение сыворотки. Способ получения иммунной чумной сыворотки,включающий парентеральную иммунизацию кроликов антигеном, с последующим забором у них крови и отделением сыворотки, донорам-кроликам вводят внутривенно в качестве иммунизирующего агента фракцию 1, полученную из авирулентного штамма бактерииВ-195 в дозе 0,2 мг 0,25 мг 0,3 мг 0,35 мг 0,4 мг в 1,0 см 3 0,85-ого раствора хлорида натрия с 4-х дневным интервалом,с одновременным внутримышечным введением в качестве иммуностимулятора полиоксидония в дозе 0,25 мг в 0,5 см 3 0,85-ого раствора хлорида натрия,затем через 7 дней после последней иммунизации,после проверки титров антител, и при получении титров антител в РНГА 1100000 и выше, проводят полное кровопускание и получают целевой продукт. Для получения фракции 1 используют штамм бактерииВ-195, который храниться в музее живых культур РГКП Казахский научный центр карантинных и зоонозных инфекций им. М. Айкимбаева. Штамм характеризуется следующими признаками Происхождение штамма бактерии. Штамм выделен от человека в 1926 г на Мадагаскаре. Особенностью штамма является авирулентность,используется для приготовления чумной живой вакцины. Назначение штамма бактерий. Авирулентный штамм для приготовления вакцины, выделения 2 антигенов чумного микроба для изготовления диагностических препаратов. Состав среды и условия культивирования. Агар Хоттингера, агар Мартена, 6 кровяной агар,сердечно-мозговой бульон. Морфолого-культуральные свойства. Грамотрицательная палочка, овоидной формы,окрашивается биполярно. Неподвижна, имеет капсулу, спор не образуют. Факультативный анаэроб. Хорошо культивируется на простых питательных средах. Ферментирует большинство углеводов без образования газа. Образует два типа колоний - молодые и зрелые. Молодые с неровными краями. Зрелые колонии крупные, с бурым зернистым центром и неровными краями. Физиолого-биохимические свойства. Оксидаза негативна, каталаза положительна, ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, ксилозу,мальтозу, маннитол, маннозу. Не ферментирует глицерин, арабинозу, сахарозу, лактозу, рамнозу,дульцит, эритрит, мелибиозу, целлобиозу, инозитол. Индол, сероводород, ацетон не образует. Маркерные признаки штамма. Лизируется при 28 С и 37 С диагностическими чумным Покровским,Л-413,диагностическим псевдотуберкулезным. Агглютинируется чумной диагностической сывороткой. Способ, условия и состав среды для хранения. Условия для размножения штамма - среды Хоттингера, агар Мартена, 6 кровяной агар,сердечно-мозговой бульон. Условия для хранения штамма - агар Хоттингера, лиофильно высушенное состояние, криоконсервирование при -70 С в растворе глицерина. Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Способ получений иммунной чумной сыворотки к фракции 1 чумного микроба осуществляется следующим образом. Пример 1. Предварительно получают бактериальную массу штамма бактерииВ-195. После изучения микробиологических и биохимических свойств,В-195 засевается на чашки Петри с пластинками агара Хоттингера. Чашки выдерживаются в термостате при температуре 28 С в течение 48 часов, затем ставятся на 48 часов в термостат при 37 С для образования фракции 1 чумного микроба. Из выросших культур готовится взвесь бактерииВ-195 для посева на матрацы. Засевается 40 матрацов с агаром Хоттингера 7,27,4 с добавлением в питательную среду 1 хлорида кальция и 0,5 гемолизированной бараньей крови для стимуляции роста микробов. Засеянные матрасы помещают в термостат при 28 С на 48 часов, затем выдерживают еще 48 часов при 37 С. Выросшую бактериальную массу смывают с матрацев 0,9-ным раствором хлорида натрия, собирают в бутыль и заливают 2-х кратным объемом холодного ацетона для фиксации микробных клеток. Взвесь микробных клеток фильтруют через ватман 1 в воронке Бюхнера, 30317 затем переносят фильтр с бактериальной массой в эксикатор и высушивают под вакуумом. Для выделения фракции 1 чумного микроба используют методикуи др. (1952),основанную на экстракции из сухой бактериальной массыВ-195 антигенов клеточной стенки чумного микроба с помощью 2,5-ого раствора хлорида натрия с добавлением 1 толуола,с последующим осаждением из раствора фракции 1 при 30-ом насыщении концентрированным раствором сульфата аммония. Пример 2. В качестве продуцентов отбирают здоровых кроликов весом 2,5-3 кг, а качестве иммунизирующего агента используют фракцию 1,полученную из штамма бактерииВ-195, который вводят внутривенно в возрастающих дозах - 0,2 мг 0,25 мг 0,3 мг 0,35 мг 0,4 мг в 1,0 см 3 0,85-ого раствора хлорида натрия, с интервалом 4 дня. В эти же сроки, в качестве иммуномодулятора, внутримышечно инъецируют по 0,25 мг в 0,5 см 3 0,85-ого раствора хлорида натрия полиоксидония. На 7-й день после последней иммунизации кроликов проверяют титры антител в РНГА. В случае получения титров антител в сыворотке 1100000 и выше,кроликов кровопускают. Использование в качестве иммуномодулятора полиоксидония способствует значительному повышению титров специфических сывороточных антител за счет стимулирования функциональной активности клеток иммунной системы непосредственно нейтрофилов,моноцитов/макрофагов и естественные киллеров,опосредованно - клеточный и гуморальный иммунитет ( Хаитов, Б.П. Пинегин. Новые лекарственные средства 3, 2003 г., с.56-62.). При сопоставлении со способом-прототипом выявлены следующие преимущества сокращение длительности процесса иммунизации с 45-50 до 2730 дней за счет исключения этапа подготовки животных к иммунизации и одновременных инъекций антигена и иммуномодулятора,повышение выхода целевого продукта за счет увеличения антителообразования у животных продуцентов и уменьшения расхода антигенных материалов,значительное повышение специфической активности сывороток в РНГА с 15000 - 110000 до 1100000 и выше. Использование изобретения в биотехнологии позволит получать высокоактивные, специфичные сыворотки для производства диагностических препаратов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения иммунной чумной сыворотки,включающий парентеральную иммунизацию кроликов антигеном, с последующим забором у них крови и отделением сыворотки, отличающийся тем, что донорам-кроликам вводят внутривенно в качестве иммунизирующего агента фракцию 1,полученную из авирулентного штамма бактерииВ-195 в дозе 0,2 мг 0,25 мг 0,3 мг 0,35 мг 0,4 мг в 1,0 см 3 0,85-ого раствора хлорида натрия с 4-х дневным интервалом, с одновременным внутримышечным введением в качестве иммуностимулятора полиоксидония в дозе 0,25 мг в 0,5 см 3 0,85-ого раствора хлорида натрия, затем через 7 дней после последней иммунизации, после проверки титров антител, и при получении титров антител в РНГА 1100000 и выше, проводят полное кровопускание и получают целевой продукт.