Способ получения сыворотки для диагностики метапневмовируса птиц

(51) 61 39/145 (2006.01) 61 31/12 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ МЕТАПНЕВМОВИРУСА ПТИЦ(57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Способ получения сыворотки для диагностики метапневмовируса птиц(МПВИ) предусматривает накопление вирусной массы, сбор вируссодержащей суспензии, обработку ультразвуковыми волнами вируссодержащей суспензии с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-1 при частоте 20-30 кГц,мощности 50-70 Вт/см 2 в течение 5-10 минут,очистку вируса в градиенте сахарозы,гипериммунизацию продуцентов,получение сыворотки. Предлагаемый способ способствует повышению сыворотки.(72) Асанов Ныгмет Гатауович Сансызбай Абылай Рысбаевич Кошеметов Жумагали Каукарбаевич Мусина Галия Шайхисламовна Мусоев Асылбек Маилибоиевич(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Казахский национальный аграрный университет Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Дмитриев Д.В. Непрямой метод иммуноферментного анализа в диагностике метапневмовирусной инфекции птиц. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук. Санкт-Петербург,2010 Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Известен способ получения сыворотки для диагностики метапневмовируса птиц, включающий накопление вирусной массы, сбор вируссодержащей суспензии, очистку вируса в градиенте сахарозы,гипериммунизацию продуцентов,получение сыворотки(Д.В.Дмитриев. Непрямой метод иммуноферментного анализа в диагностике метапневмовирусной инфекции птиц. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук. Санкт-Петербург 2010). Недостатком данного способа является низкая активность сыворотки. Задача заявляемого изобретения - повышение активности сыворотки. Задача решается путем обработки ультразвуковыми волнами вируссодержащей суспензии с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-1 при частоте 20-30 кГц,мощности 50-70 Вт/см 2 в течение 5-10 минут. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в повышении активности целевого продукта. Способ получения сыворотки для диагностики метапневмовируса птиц (МПВИ) предусматривает накопление вирусной массы, сбор вируссодержащей суспензии, обработку ультразвуковыми волнами вируссодержащей суспензии с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-1 при частоте 20-30 кГц, мощности 50-70 Вт/см 2 в течение 5-10 минут, очистку вируса в градиенте сахарозы,гипериммунизацию продуцентов,получение сыворотки. Пример получения сыворотки для диагностики мегапневмовируса птиц. А. Работа со штаммом. Штамм-21 метапневмовируса птиц свободен от контаминации бактериями,микоплазмами и другими гемагглютинирующими вирусами и используется для приготовления вакцин и диагностических препаратов при метапневмовирусной инфекции птиц (МПИП). Для получения антигенного материала из штамма -21 вируса МПВИ в качестве чувствительной системы культивирования используют культуру клеток . Б. Приготовление и контроль нормального и специфического антигенов метапневмовируса птиц Технология получения вируссодержащей культуральной суспензии для приготовления нормального и специфического антигенов Для получения вируссодержащей культуральной суспензии используют матрасы емкостью 1,0-1,5 дм 3 со сплошным монослоем культуры клетокв стационарных условиях при температуре(37,50,5)С. Вакцинный штамм -21 метапневмовируса птиц имел максимальное накопление 6,00,1 ТЦД 50/см 3. Перед заражением из матрасов удаляют питательную ростовую среду. После внесения 2 заражающей дозы вируса матрасы выдерживают в течение 1,-1,5 ч при (371)С. осторожно покачивая каждые 15-20 мин. Затем в матрасы заливают 100150 см 3 поддерживающей среды . Матрасы помещают в термостат и инкубируют при (371)С. до наступления полного поражения клеток. Для приготовления нормальных и специфических комплексных антигенов МПИП монослой в неинфицированных матрасах и пораженный вирусом монослой инфицированных матрасах снимают стерильным резиновым шпателем, определяя полноту снятия визуально. Вируссодержащую суспензию и контрольную суспензию неинфицированных культуры клеток сливают раздельно в стерильные сосуды емкостью не менее 10 дм 3 каждый. Полученный производственный вирус проверяют на цитопатогенную активность путем титрования в однослойной пробирочной культуре клеток . Производственный вирус должен иметь активность не менее 5,0 ТЦД 50/см 3. В. Приготовление антигена Полученную культуральную вируссодержащую суспензию подвергают обработке ультразвуковыми волнами с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-1 при частоте 20-30 кГц, мощности 50-70 Вт/см 2 в течение 5-10 минут, затем концентрируют путем центрифугирования в 0,5-1 дм 3 стерильных стаканах рефрижераторной центрифуги. Центрифугирование проводят при 3000 об/мин (42)С в течение 30 мин (64-). После остановки центрифуги надосадочную жидкость из стаканов сливают в отдельную посуду, а в стаканы с осадком добавляют новую порцию суспензии. Затем суспензию центрифугируют при 27000 об/мин в течение одного часа при температуре (42)С(42)С. Надосадок используют как антиген в РНГА, РДП и ИФА. Г. Гипериммунизация продуцентов Первой стадией получения сывротки является иммунизация животных. В качестве продуцентов специфической сывротки используют клинически здоровых курицы в возрасте 20 недельных, не содержащих в крови антител к возбудителям сходных заболеваний. Специфическую сывротку для серологических реакций при МПИП получают по схеме трехкратное подкожное а) иммунизация - введение животным 1 м 3 антигена б) гипериммунизация- первая инъекция - введение 15 см 3 культурального концентрированного антигена в комплексном с ГОА гидрооксильалюмений (0,2 см 3 2) интервал 30 сут- вторая инъекция - введение 30 см 3 культурального концентрированного антигена и 0,8 см 3 адъювант Монтанид 71 9 сут В процессе гипериммунизации за курами ведут клиническое наблюдение. Очередную инъекцию антигена делают только курам с нормальной температурой тела. Через каждые 7 сут после последней инъекции у кур из ярменой вены берут кровь и определяют титр антител в ИФА и РДП. При установлении в сыворотках крови необходимого титра проводят тотальное обескроливание. Д. Получение сыворотки Кровь у продуцентов берут в стерильные цилиндры, содержащие небольшое количество (20 30 см 3) физиологического раствора для смачивания стенок цилиндра. Цилиндры с кровью для формирования сгустка вначале помещают на 3-4 ч в термостат при (371)С, а затем на 12-15 ч в холодильник при (42)С. Отстоявшуюся сыворотку сливают в стерильные флаконы, а сгустки крови утилизируют. При наличии в сыворотке форменных элементов крови ее центрифугируют в стерильных центрифужных стаканах в течение 15-20 мин при 1500-2000 об/мин. Полученную сыворотку проверят на активность и специфичность в ИФА и РДП. Проверку сывороток крови на стерильность проводили ГОСТ 44832005. Таблица 1 Сравнительные данные по активности и специфичности сыворотки в ИФА Группа Опытная ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения сыворотки для диагностики метапневмовируса птиц, включающий накопление вирусной массы, сбор вируссодержащей суспензии,очистку вируса в градиенте сахарозы,гипериммунизацию продуцентов,получение сыворотки,отличающийся тем,что вируссодержащую суспензию подвергают обработке ультразвуковыми волнами с помощью ультразвукового диспергатора при частоте 20-30 кГц, мощности 50-70 Вт/см 2 в течение 5-10 минут.