Способ определения качества супернатанта фетальных гепатоцитов

(51) 01 33/50 (2006.01) 01 30/02 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ супернатанта фетальных гепатоцитов (СФГ) перед этапом криоконсервации и в процессе хранения. Техническим результатом изобретения является сокращение времени определения и снижение экономических затрат на проведение тестирования. Это достигается тем, что в заявляемом способе определения качества супернатанта фетальных гепатоцитов путем тестирования образцов, согласно изобретению, проводят скрининг-тестирование методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с получением данных в виде обзорной хроматограммы, состоящей из трех пиков,при этом, если в отчете хроматограммы последовательность пиков по высоте идет как 1 -2-3,с максимальным по высоте пиком 1, соотношение цифрового значения пика 1 к пику 2 в пределах от 1.1 до 1.5, то образец считается качественным.(72) Амирова Анар Калиназаровна Доскалиев Жаксылык Акмурзаевич Каюпов Болатбек Амангельдиевич(56) Муталляпова Г.З. Новые подходы в тестровании фетальных тканей методом ПЦР // Астана медициналык журналы, 2011, 2 (64), с.156158(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАЧЕСТВА СУПЕРНАТАНТА ФЕТАЛЬНЫХ ГЕПАТОЦИТОВ(57) Изобретение относится к медицине, в частности к биотехнологии и может быть использовано для определения качества Изобретение относится к медицине, в частности к биотехнологии и может быть использовано для определения качества супернатанта фетальных гепатоцитов (далее - СФГ) перед этапом криоконсервации и в процессе хранения. Известен способ определения качества супернатанта фетальных гепатоцитов путем тестирования образцов методом полимеразно цепной реакции (далее - ПНР).(Муталляпова Г.З. Новые подходы в тестровании фетальных тканей методом ПЦР / Астана медициналык журналы, 2011,2 (64), с. 156 - 158) Недостатком данного способа является его трудоемкость, а также наличие дорогостоящих наборов и реагентов для проведения серий тестов и анализов, длительность анализа по времени проведения. Задачей изобретения является создание эффективного способа определения качества СФГ позволяющего, в минимально короткое время,провести дифференцировку, с целью выявления образцов, свободных от бактериальной, вирусной и протозойной контаминации перед этапом криоконсервации. Техническим результатом изобретения является сокращение времени определения, (простоты метода подготовки пробы к анализу, отсутствие в необходимости маркера,стандарта образца,сложных расчетов и формул) и снижение экономических затрат на проведение тестирования. Это достигается тем, что в заявляемом способе для определения качества СФГ проводят скринингтестирование методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ),позволяющий, не добиваясь полного разделения анализируемой смеси, в стандартизированных условиях получать обзорные хроматограммы, в виде хроматографических профилей, состоящих из трех последовательных пиков, с установленным временем выхода пик 1 - 5,3950,033 мин., пик 2 - 5,5750,036 мин., пик 3 - 5,9780,026 мин. Хроматограмма образца,свободного от бактериальной,вирусной и протозойной контаминации состоит из трех последовательных пиков 1, 2, 3, с максимальным по высоте пиком 1,соотношение цифрового значения пика 1 к пику 2 в пределах от 1.1 до 1.5. Хроматограмма контаминированного образца,состоит из трех последовательных пиков 1, 2, 3, с максимальным по высоте пиком 2, соотношение цифрового значения пика 1 к пику 2 в пределах от 0,6 до 0,9. Способ осуществляется следующим образом. Образец СФГ размораживают на водяной бане 37 в течение 5 мин с дальнейшим центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин. 0,5 мл образца смешивают с ацетонитрилом для депротеинизации в соотношении 110 и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Перед вводом в систему хроматографа подготовленный образец отфильтровывают через мембранный фильтр 130.45 . Элюирование проводят смесью ацетонитрил - вода,скорость потока 0,5 мл/мин, объем вводимой пробы 10 мкл. Необходимое количество образца для проведения анализа 0,5 мл и время анализа 10 мин. Результат анализа получают в виде протокола с хроматограммой и табличными данными,содержащие данные о времени выхода и цифрового значения каждого пика. Интегрирование проводят в автоматическом режиме по высоте пика. Обзорная хроматограмма качественного образца СФГ (стерильного, имеющие отрицательный результат теста на наличие бактериальной, вирусной и протозойной контаминации) состоит из трех последовательных пиков с максимальным значением высоты пика 1, последовательность пиков по высоте 1, 2, 3, соотношение цифрового значения пика 1 к пику 2 в пределах от 1.1 до 1.5. Данный образец при контрольной проверке на микробиологическую стерильность и тестировании методом ПЦР на наличие бактериальной, вирусной и протозойной контаминации имеет отрицательный результат теста. В контаминированных образцах изменяется последовательность пиков по высоте 2-1-3,соотношение цифрового значения пика 1 к пику 2 менее 1.0. в пределах от 0,6 до 0,9 такой образец является некачественным, не годен для дальнейшего использования. Пример 1. Исследовали образец СФГ 64 на микробиологическую стерильность,результат анализа образец стерильный. Провели тестирование методом ПЦР на наличие бактериальной,вирусной и протозойной контаминации, результат анализа - образец свободен от контаминаций. Результат анализа ВЭЖХ образец качественный, на хроматограмме максимальный по высоте пик 1, последовательность пиков по высоте 1, 2, 3, соотношение цифрового значения пика 1 к пику 2 в переделах от 1.1 до 1.5. Исследовали образец СФГ 10 на микробиологическую стерильность,результат анализа - образец нестерильный. Провели тестирование методом ПЦР на наличие бактериальной,вирусной и протозойной контаминации, результат анализа - положительный тест на. Результат анализа ВЭЖХ образец некачественный, на хроматограмме максимальный по высоте пик 2, последовательность пиков по высоте 2, 1,3, соотношение цифрового значения пика 1 к пику 2 в пределах от 0,6 до 0,9. Таким образом,предлагаемый способ предназначен для экспресс- тестирования, путем скрининга провести дифференцировку с целью отбора качественных образцов СФГ для криоконсервирования, а также для тестирования качества при длительном хранении. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ определения качества супернатанта фетальных гепатоцитов путем тестирования образцов, отличающийся тем, что проводят скрининг-тестирование методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, позволяющий в стандартизованных условиях получать хроматографические профили, состоящих из трех пиков, при этом, если последовательность пиков по высоте соответствует 1, 2, 3 с максимальным по высоте пиком 1, соотношение цифрового значения пика 1 к пику 2 в пределах от 1.1 до 1.5, то образец считают качественным. .