Способ определения полного генома мтДНК

(51) 12 1/68 (2009.01) 12 15/10 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Цель достигается тем, что первоначально нарабатываются ПЦР-продукты со специфическими праймерами(17 пар). Образуемые при амплификации фрагменты ДНК имеют хорошую область перекрывания между собой (до 100 нуклеотидов). Далее проводится очистка ПЦРпродуктов. Следующим шагом проводят ПЦРсеквенирование с последующей очисткой. Затем непосредственно разделение фрагментов проводят,используя генетический анализатор. После того как определены нуклеотидные последовательности отдельных фрагментов, проводят сборку этих фрагментов в полный геном. За счет большого перекрывания ДНК фрагментов между собой не образуются гэпы. Таким образом, определяют полный геном мтДНК размером порядка 16569 пар оснований. Применение данного способа позволит достоверно определять полный геном мтДНК, а также упростить и сократить время анализа, и значительно удешевить его.(72) Жолдыбаева Елена Витальевна Тарлыков Павел Викторович Момыналиев Куват Темиргалиевич Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛНОГО ГЕНОМА МТДНК(57) Изобретение относится к области молекулярной биологии и популяционной генетики,и может быть использовано в криминалистке. Способ обеспечивает определение нуклеотидной последовательности полного генома мтДНК. Целью исследования является оптимизация расшифровки полного генома мтДНК. Изобретение относится к области молекулярной биологии и популяционной генетики и может быть использовано в криминалистике для идентификации личности. мтДНК человека представлена кольцевой молекулой размером 16569 пар нуклеотидов (п.н.),локализованной внутри митохондриального матрикса. Митохондриальная ДНК передается потомкам только от матери, так как митохондрии находятся в цитоплазме клетки, а цитоплазма потомка (зиготы) образуется за счет цитоплазмы материнской яйцеклетки. Если два человека имеют общий предок женского пола, то по различиям их мтДНК можно судить о том, сколько поколений отделяет их от жившей столетия или тысячелетия назад общей прапрабабушки. Расшифрованные геномы мтДНК используют в криминалистике, а также в популяционной генетике. Наиболее близким аналогом является работа-,,,.,2001, 21. В данной работе описан способ определения полного генома мтДНК на основе ДНК-секвенирования. Недостатком данного аналога является то, что для определения полного генома мтДНК используют большое количество. При сборке в полный геном амплифицированные фрагменты перекрываются между собой всего на 20 нуклеотидов, что влечет за собой образование гэпов. Задачей исследования является оптимизация расшифровки полного генома мтДНК. Технический результат удешевление,упрощение способа и сокращение времени анализа заявляемым способом. Сущность изобретения заключается в расшифровке полного генома мтДНК человека на основе ДНК-секвенирования. Первоначально нарабатываются ПЦР-продукты со специфическими праймерами. Далее проводится очистка ПЦРпродуктов. Следующим шагом проводят ПЦРсеквенирование с последующей очисткой. Далее непосредственно разделение фрагментов проводят,используя генетический анализатор. После того, как определены нуклеотидные последовательности отдельных фрагментов, проводят сборку этих фрагментов в полный геном. Таким образом,определяют полный геном мтДНК размером порядка 16569 пар оснований. Сущность изобретения поясняется следующим конкретным примером в таблице. Важной особенностью является то, что все ПЦР продукты нарабатываются при одном температурном режиме 94 - 3 минуты 35 циклов 94 - 30 секунд 56 - 30 секунд 72 - 1 минута 72 - 7 минут Детекция наработанных продуктов в 1,5 агарозном геле методом электрофореза представлена на фиг. Очистку ПЦР-продуктов проводили любым коммерческим набором согласно инструкции производителя, ПЦР-секвенирование - протоколу производителя. Очистку продуктов после ПЦР-секвенирования проводили с помощью спиртового осаждения по стандартному протоколу. Определение нуклеотидных последовательностей проводили с помощью генетического анализатора 3730,США). Сборку ДНК фрагментов в полный геном проводили с помощью пакета компьютерной программы( 6.0 , , ). Таблица Праймеры, используемые для амплификации использовали Название Последовательность 5-3 Размер ПЦРпродукта (пар оснований) Таблица Протокол для постановки ПЦР Компоненты 10 ПЦФ буфер дНТФ (10 мМ) Праймер прямой (10 рмол)обратный (10 рмол) Матрица ДНК (до 10 нг) Вода ДНК-полимераза (5 ед акт/мкл) отличающийся тем, что для расшифровки полного генома мтДНК используют 17 пар специфических праймеров. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ определения полного генома мтДНК основан на прямом ДНК-секвенировании, Электрофореграмма ПЦР-продуктов в 1,5 агарозном геле маркер молекулярных масс (1, . 1-17 ПЦР-продукты, амплифицируемые с помощью праймеров (представленных в таблице). Верстка Косалиева Б. Корректор Мадеева П.А.