Получение флотирующей культуры фетальных островковых клеток поджелудочной железы

(51) 12 5/08 (2009.01) 12 1/00 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН Изобретение относится к медицине, а именно к фетальной терапии, и может быть использовано при подготовке к имплантации фетальных островковых клеток поджелудочной железы больным с различной патологией поджелудочной железы. Известен способ культивирования фетальных нервных клеток(Жолмухамедов К.К.,Засорин Б.В., Конысова А.Ж., Искакав А.Ж., и др.,предпатент 15834 от 29.04.2003). Когда культивирование фетальных клеток происходила в сложной питательной среде при температуре 37 С. Недостатком этого способа является сохранения жизнеспособности клеток в условияхявляется нарастание дегенеративных изменений в них уже на ранних стадиях хранения. Данное обстоятельство не позволяет применить данный способ при длительном хранении островковых клеток поджелудочной железы. Задачей предлагаемого изобретения является создание способа длительного культивирования фетальных островковых клеток поджелудочной железыпозволяющего сохранить их 10 мл свежеприготовленной на растворесуспензии фетальных островковых клеток поджелудочной железы в 70 мл питательной среды-1640,обогащенной инактивнрованной эмбриональной телячьей сывороткой,10 раствором глюкозы с добавлением трипсина,-глутамина,инсулина,стрептомицина,пенициллина и гентамицина в атмосфере 5 С 2 при температуре 37 в течении, с заменой среды и контролем жизнеспособности каждые 5-6 дней,осуществляется в течение длительного времени в сложной синтетической питательной среде с добавлением специфических биоактивных веществ,способствуя сохранению функциональной активности фетальных клеток. Внедрение данного способа позволит- создать банк фетальных клеток длительно сохранять функциональную активность фетальных клеток.- широко проводить трансплантацию фетальных островковых клеток поджелудочной железы в клинике. жизнеспособность в течение длительного времени и увеличить количественную концентрацию клеток. Способ включает культивирование 10 мл свежеприготовленной на растворесуспензии фетальных островковых клеток железы в 70 мл питательной охлажденной (4 С) среды 1640,обогащенной инактивированной эмбриональной телячьей сывороткой,10 раствором глюкозы с добавлением трипсина,-глутамина, 0,12 ед/мл инсулина, стрептомицина,пенициллина и гентамицина в атмосфере 5 СО 2 при температуре 37 С в течение 30 суток, с заменой среды и контролем жизнеспособности каждые 6 дней. Способ осуществляется следующим образом Б 70 мл охлажденной (4 С) среды питательной среды, состоящую из - среда-1640 (60),инактивированная эмбриональная телячья сыворотка (25), 10 раствор глюкозы (12),трипсин (1), -глутамин (1), стрептомицин,пенициллин и гентамицин из расчета 100 ед/мл,0,12 ед/мл инсулина, помещают 10 мл с свежеприготовленной суспензии фетальных(72) Келимбердиев Мирсаид Саубетович Омарова Куляш Примжановна Засорин Борис Викторович(73) Республиканское государственное казенное предприятие Западно-Казахстанский государственный медицинский университет им. Марата Оспанова Министерства здравоохранения Республики Казахстан(54) ПОЛУЧЕНИЕ ФЛОТИРУЮЩЕЙ КУЛЬТУРЫ ФЕТАЛЬНЫХ ОСТРОВКОВЫХ КЛЕТОК ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ(57) Изобретение относится к медицине, а именно к фетальной терапии, и может быть использовано при подготовке к имплантации островковых клеток поджелудочной железы больным с различной патологией поджелудочной железы. Способ получения флотирующей культуры фетальных островковых клеток поджелудочной железы, включающий культивирование 23983 островковых клеток поджелудочной железы на растворе(содержание клеток 2,0106 кг/мл). После чего, оставляют флакон с клеточной культурой при температуре (22-24 С) на 48 часов. По окончанию этого срока суспензию клеток трижды по 5 минут отмывают центрифугированием в растворе при 1500 об/мин. После последнего центрифугирования надосадок и верхнюю часть осадка удаляют, а клеточную взвесь ресуспензируют в питательной среде до средней концентрации 3106 мл. Затем суспензию клеток помещают в 50 мл питательной среды во флаконы для культур клеток и культивируют в течение 30 суток при температуре 37 С в атмосфере 5 2. Замену питательной среды проводят каждые 5-6 суток. Контроль жизнеспособности клеток осуществляют посредством витального окрашивания 0,1 раствором трипанового синего. Пример. Клеточную суспензию фетальных островковых клеток поджелудочной железы,полученных от 8 человеческих фетусов разделяли на 2 серии (по 30 проб в каждой). Первую помещали в сложную питательную среду и хранили при температуре 37 С (по способу прототипа). Вторую культивировали по предлагаемой методике. Жизнеспособность клеток в условияхопределяли ежедневно, так же проводили морфологическую оценку клеточных структур. Исходная жизнеспособность фетальных островковых клеток поджелудочной железы составляла 78,33,4. Через сутки консервации фетальных островковых клеток поджелудочной железы по способу прототипа жизнеспособность клеток составляла 64,16,4 из них 27,9-2,8 имели различную степень выраженности дегенеративных изменений. На вторые сутки жизнеспособность равнялась 57,2 7,2, а дегенеративные изменения наблюдались в 36,43,9 клеток. Через трое суток число жизнеспособных клеток составляло 42,85,3,признаки дегенеративных изменений выявлены в 72 клеток. Так как качество суспензии клеток не соответствовало требованиям,предъявляемым для донорских клеток дальнейшее наблюдение было прекращено. При культивировании фетальных островковых клеток поджелудочной железы предлагаемым способом через сутки жизнеспособность составляла 80,94,6, дегенеративные изменения выявлялись в 13,62,9 случаев. После 48 часов культивирования 73,44,9 клеток являлись жизнеспособными,18,82,2 имели признаки внутриклеточной дегенерации. После центрифугирования и удаления надосадка с верхним слоем клеточного осадка (слои содержит массу поврежденных и дегенеративно измененных клеток) жизнеспособность фетальных островковых клеток поджелудочной железы составила 97,42,6, клетки с признаками дегенерации выявлялись в 5,20,8 случаев. Оценка жизнеспособности и внутриклеточных изменений в течение последующих 30 суток представлены в таблице 1. Таблица 1- широко проводить трансплантацию фетальных использование метода прототипа позволяют островковых клеток поджелудочной железы в некоторое время поддерживать жизнеспособность клинике. островковых клеток поджелудочной железы,однако деструктивные изменения в них уже через ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ трое суток приводят к их непригодности для трансплантации. В то же время применение Способ получения флотирующей культуры предлагаемого способа способствует длительному фетальных островковых клеток поджелудочной сохранениюжизнеспособности фетальных железы, включающий культивирование островковых клеток поджелудочной железы с 10 мл свежеприготовленной на раствореминимальным (не более 8) количеством суспензии фетальных островковых клеток деструктивно измененных клеток. поджелудочной железы в 70 мл питательной среды Преимуществом предложенного способа -1640,обогощенной инактивированной получения флотирующей культуры фетальных эмбриональной телячьей сывороткой,10 островковых клеток поджелудочной железыраствором глюкозы с добавлением трипсина,является длительное сохранение их -глутамина,инсулина,стрептомицина,жизнеспособности с минимальной деградацией пенициллина и гентамицина в атмосфере 5 СО 2 внутриклеточных структур,что позволяет при температуре 37 в течении 30 суток, с заменой использовать данные клетки для имплантации среды и контролем жизнеспособности каждые 5-6 больным с различными поражениями дней,отличающийся тем,для удаления поджелудочной железы. поврежденных клеток и других примесей Внедрение данного способа позволит осуществляют преинкубацию в течении 48 часов- создать банк фетальных клеток при температуре 22-24.- длительно сохранять функциональную активность фетальных клеток