Штамм бактерий Rhodococcus ruber Кл4, используемый для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов

(51) 12 1/20 (2009.01) 09 1/10 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к области биотехнологии и экологии и касается получения нового штамма бактерий, который может быть использован для очистки почвенных экосистем от нефти и нефтепродуктов. Штамм бактерийКл 4 используют для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов. Штамм депонирован в коллекции ДГП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП НЦБ РК КН МОН РК под номером - 0265. Предлагаемый штаммКл 4 активно утилизирует сырую нефть при концентрации 10 на 60,5. В лабораторных условиях снижает концентрацию нефти в почве на 46,5 за 30 суток, что улучшает экологическую обстановку окружающей среды.(72) Кульжанова Камшат Арыстановна Туякбаева Акмарал Усерхановна Апендина Гульжанат Серикбаевна Саданов Аманкелди Курбанович Чукпарова Айгуль Ултараковна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Предварительный патент РК 19842, 12 1/20, В 09 С 1/10, 2008 КЛ 4,ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ 23490 Изобретение относится к области биотехнологии и экологии и касается получения нового штамма бактерий, который может быть использован для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов. Известен штамм нефтеокисляющих микроорганизмовдля разложения нефти и нефтепродуктов (Патент РФ 2005138607/13, 2005). Наиболее близким аналогом является штамм бактерий 7-,используемый для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов (предпатент РК 19842, 2008). Недостатком данного штамма является низкая степень деградации нефти. Задачей изобретения является получение нового штамма бактерий,характеризующегося нефтеокисляющей активностью при высокой концентрации нефти. Штамм бактерийКл 4 используют для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов. Предлагаемый штаммКл 4 впервые выделен из естественных источников из нефтезагрязненной почвы месторождения Каражанбас Мангистауской области. Техническим результатом изобретения является ускорение процесса очистки почвы от нефти и нефтепродуктов до полного разложения углеводородов нефти в короткие сроки (30 суток). Характеристика штамма Штамм выделен из нефтезагрязненной почвы Мангистауской области. Штамм представляет собой подвижные палочки. Грамположительные,кислотоустойчивые, не образует спор. На МПА культура образует колонии с ровными краями,влажные, со слизистым содержимым, колонии розового цвета диаметром 2-3 мм. Консистенция мягкая, легко снимается с поверхности агара. Колонии сливаются между собой, пигментов в среду не выделяет. Аэроб. При росте на СПБ образует тонкую бесцветную пленку, исчезающую при встряхивании среды, бульон прозрачный со скудным осадком. Штамм не токсичен и не патогенен. Физиолого-биохимические признаки В качестве источника углерода использует лактозу с образованием кислоты. Желатину не разжижает, крахмал гидролизует. Сероводород образует, индол образует. Не восстанавливает нитраты до нитритов. Дает положительную реакцию на каталазу и отрицательную на оксидазу. Образует рост на СПБ при 7 . Растет при температуре 1540 С, оптимум температуры роста 2537 С. Хранят на скошенных агаризованных средах с 1 нефтью или с углеводородом при температуре 4 С. Пересев осуществляют 2 раза в год. Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культуральноморфологических и физиолого-биохимических характеристик в соответствии с описанием, данным в определении бактерий Берджи 1997, а также на 2 основании изучения последовательности генов 16. Штамм характеризуется высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов. Штамм бактерийКл 4 депонирован в коллекции ДТП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП НЦБ РК КН МОН РК под номером - 0265. Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами Пример 1. Изучена нефтеокисляющая активность штаммаКл 4 при выращивании на минеральной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода и энергии сырую высокопарафиннистую нефть Каражанбас в концентрации 7 и 10. Для оценки нефтеокисляющей активности культуру выращивают на минеральной среде Ворошиловой-Диановой следующего состава, г/л-10,0 43 - 1,0 К 2 НРО 4 - 1,0 КН 2 РО 4 - 1,0 472 - 0,2 СаС 2 - 0,02 дистиллированная вода - 1 л, рН среды 7,0-7,2. Среду разливают по 100 мл в качалочные колбы объемом 250 мл и стерилизуют при 1 атм. 30 минут. Суспензию бактерий получают путем смыва с поверхности скошенной среды 1 мл стерильной воды и вносят в среду. В качестве единственного источника углерода используют высокопарафинистую сырую нефть в количестве 7 и 10. Культивируют на качалке 180 об./мин при температуре 28-30 С в течение 14 суток. Потребление нефти определяют гравиметрическим методом, экстрагируя остаточную нефть гексаном и хлороформом. Данные представлены в таблице 1. Деструкция алифатической и ароматической фракции нефти определяли методом ГЖХ. Контролем служит минеральная среда с нефтью без внесения микроорганизмов. Данные представлены в таблице 2. Результаты исследований показали,что предлагаемый штамм бактерий способен использовать 7 и 10 сырую нефть в жидкой среде Ворошиловой-Диановой, так деструкция на 14-е сутки 7 нефти составила 78,7, а 10 - 60,5. Пример 2. Очистка нефтезагрязненной почвы. Используют нефтезагрязненную бурую солонцеватую почву с месторождения Жанаталап. В эксикаторы берут почву в количестве 350 г. Вносят 5 г минерального удобрения Нитроаммофоска. Для очистки почвы готовят суспензию с использованием штаммаКл 4 плотность 109 клеток в 1 мл. Приготовленную суспензию равномерно распределяют на нефтезагрязненную почву. Контролем служил загрязненная нефтью почва без внесения культур. Время культивирования 30 суток. Остаточное количество нефти в почве определяли гравиметрическим методом, экстрагируя нефть хлороформом. Исходное содержание нефти в почве первоначально составило 52 г/кг. О биодеструкции нефти судили по ее остаточному содержанию нефти. Результаты исследования показали, что при внесения штаммаКл 4 деструкция 23490 нефти составило за 30 суток - 46,5. Данные представлены в таблице 3. Таким образом,предлагаемый штаммКл 4 способен утилизировать сырую нефть в почве и может быть использован для очистки нефтезагрязненных почв. Таблица 1 Потребление сырой нефти штаммомКл 4 при разной ее концентрации Варианты Степень утилизации сырой нефти за 14 суток,7 10 3,85 3,67 78,7 60,5 Таблица 2 Деструкция нефти культурой 7 сырой нефти в жидкой среде Название культуры КонтрольКл 4 Общее содержание нефти 2,7 38,21 Алифатическая фракция нефти 4,8 19,88 Ароматическая фракция нефти 3,6 46,19 Таблица 3 Степень деградации нефти в почве под воздействием штаммаКл 4 Варианты КонтрольКл 4 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерийКл 4 Республиканская коллекция микроорганизмов РГП НЦБ РК КН МОН РК, под номером 0265), используемый для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов.