Способ прогнозирования развития близорукости у детей

(51) 61 9/00 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ применение при прогнозировании развития близорукости у детей. Исследуют венозную кровь больного, к которой добавляют фенольно-хромосомные экстракты в стандартных дозировках. Затем в полученный осадок добавляют олигонуклеотидные праймеры генов альфа- цепи коллагена. Фрагменты осадка разделяют путем электрофореза в 7 полиакриаламидном геле с последующим окрашиванием раствором бромистого этидия,результаты фиксируют на приборе(Великобритания). При выявлении генотипа / прогнозируют развитие близорукости. Преимущество данного способа в высокой точности прогноза развития близорукости у детей (100 ) так как исследования проводятся на молекулярногенетическом уровне.(72) Ботабекова Турсунгуль Кобжасаровна Аубакирова Айгуль Жумагалиевна Святова Гульнара Салаватовна Аханова Шолпан Куандыковна Тулетова Айгерим Серикбаевна(73) Республиканское государственное казенное предприятие Казахский ордена ЗНАК ПОЧЕТА научно-исследовательский институт глазных болезней Министерства здравоохранения Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ БЛИЗОРУКОСТИ У ДЕТЕЙ 22575 Изобретение относится к медицине, точнее к офтальмологии, и может быть использовано для прогнозирования развития близорукости у детей. Известен способ прогнозирования близорукости у детей (Мустафина Ж.Г., Святова Т.С., Аханова Ш.К. Предварительный патент 13717, на изобретение Способ прогнозирования наследственной близорукости у детей,опубликован 09.09.2003.При данном способе сыворотку крови больного сушат до постоянного веса и исследуют методом рентгенструктурного анализа на содержание пролина, гидроксипролина,глицина. При увеличении содержания пролина в 1,35-1,48 раз, гидроксипролина 1,67-1,82 раза,глицина в 1,53-1,62 раза по сравнению с контролем прогнозируют развитие близорукости. Точность способа составляет 35. Исследование сыворотки крови на содержание аминокислот коллагена, обусловлено тем, что они характеризуют состояние обмена соединительной ткани, нарушение которого способствует развитию близорукости. Однако, этот способ недостаточно точный. Задача изобретения разработка более точного способа прогноза развития близорукости. Поставленная задача решается предлагаемым способом, включающим исследование крови и согласно изобретению к исследуемой крови больного добавляют фенольно-хромосомные экстракты в стандартных дозировках. Затем в полученный осадок добавляют олигонуклеотидные праймеры генов альфа- цепи коллагена. Осадок разделяют путем электрофореза в 7 полиакриаламидном геле с последующим окрашиванием раствором бромистого этидия на приборе/, ответственный за развитие близорукости. При выявлении данного генотипа прогнозируют развитие близорукости. Способ осуществляется следующим образом 10 мл венозной крови смешивают с холодным ЕСлизис буфером 3,2) в фольконовской пробирке. Содержимое инкубируют 20-30 минут на льду,перемешивают переворачиванием каждые 10 минут,центрифугируют 10 минут при 1500 об/мин при 4 С. Супернатант сливают, пробирку оставляют перевернутой на фильтровальной бумаге в течение 1 минуты. В пробирку добавляют 15 мл холодного ЕС-буфера, инкубируют на льду 10 минут,центрифугируют 10 минут при 2500 об/мин при 4 С. Снова супернатант сливают, пробирку оставляют перевернутой на фильтровальной бумаге в течение 1 минуты, ресуспендируют осадок в 5 мл(в концентрации 20 мкг/мл) и 500 мкл 10 ,перемешивают и оставляют в водяной бане при температуре 37 С на ночь.Утром добавить 5 мл буфера,ресуспендировать при температуре 37 С, ресуспендировать в водяной бане при температуре 35 градусов 5 минут. Добавляют 6 мл 6 М 1 и перемешивают на вертексе 30 секунд. 2 Центрифугируют 15 минут при 3000 об/мин при 25 С. Супернатант переносится в чистый фалькон,добавляется 2 объема 100 спирта. Готовую ДНК вынимают пастеркой,промывают спиртом,растворяют в однократном-буфере. Полимеразную цепную реакцию проводят в 25 мкл,реактивы тщательно перемешивают и в каждую пробирку вносят 23 мкл общей реакционной смеси(праймеры), 2 мкл раствора ДНК и 1 каплю минерального масла ПЦР, используя пипетку 1000 мк. Для регистрации результатов амплификации готовят 7 акриламидный гель. В аппарат для вертикального электрофореза заливается однократный ТВЕ буфер,приготовленный на дистиллированной воде. После окончания полимеризации гель помещается в аппарат для электрофореза, вынимается гребенка,промываются. В пробирку для отрицательного контроля вместо ДНК добавляют 2 мкл деионизированнной воды. Пробирки центрифугируют 3-5 секунд. Пробирки помещают в ДНК-амплификатор. Для регистрации результатов амплификации приготавливают 7 акриламидный гель. В аппарат для вертикального электрофореза заливается однократный ТВЕ буфер, на дистиллированной воде в количестве 1 литра. После окончания полимеразации гель помещается в аппарат для электрофореза, вынимается гребенка, промываются карманы геля ТВЕ буфером. В чистой пробирке смешиваются пробы с краской буфером для нанесения проб на электрофорез в соотношении 51. В карманы геля наносится по 10-15 мкл амплификата, смешанного с буфером для нанесения проб в последовательности, соответствующей нумерации образцов. На гель наносится отрицательный и положительный контроли и маркер для определения молекулярного веса ДНК. Аппарат подключается к источнику тока и проводится электрофоретическое разделение продуктов амплификации. Гель вынимается из камеры, освобождается от стекол и окрашивается в растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл) в течение 10 минут. Гель переносится на стекло трансиллюминатора. Включается трансиллюминатор и анализируются результаты ПЦР. Фрагменты анализируемой ДНК появляются в виде оранжевых полос. Исследования проведены у 15 детей в возрасте 712 лет, из них 5 здоровых детей (контрольная группа) и 10 детей с близорукостью (основная группа). У всех детей основной группы выявлен генотип /, а в контрольной группе данный генотип не выявлен. Таким образом, генотип /, выявленный во всех случаях у детей с близорукостью является маркером развития данного заболевания. Преимущество данного способа в высокой точности прогноза развития близорукости. Точность прогноза составляет 100, исследования проводятся на молекулярно-генетическом уровне и характеризуют состояние ДНК. 22575 Пример 1. Здоровый ребенок Б. 10 лет. Находился на амбулаторном обследовании с 5 по 10 апреля 2007 году в КАЗ НИИ глазных болезней. Острота зрения ОИ 1,0 Рефракция ОИ Ем ОИ Глаза спокойные, среды прозрачные. Глазное дно без патологии. Проведено молекулярно-генетическое исследование. Заключение генотип /альфа- цепи коллагена(Со 11 А 1) не выявлен. Пример 2. Больной А. 11 лет. Находился на стационарном лечении с 5 по 10 апреля 2007 году в детском отделении КАЗ НИИ глазных болезней диагнозом ОИ Миопия врожденная наследственная высокой степени изометропическая с астигматизмом осложненная хориоретинальная начальная. Данные офтальмологического обследования Острота зрения 0, /к (-)6,50,40, /к (-)6,00,4 Данные рефрактометрии 7,25-.00 ах 16- -7,75-1.50 ах 103 ОИ - роговица прозрачная, сферическая,передняя камера средней глубины,влага прозрачная. Зрачок круглый, в центре, реакции сохранены. Хрусталик прозрачный. ДЗН б/розовый,бледноватый с височной стороны, овальной формы вытянут, сдвиг сосудистого пучка в носовую сторону, миопический конус 1/3 ДД. Макулярные рефлексы просматриваются,сглажены. Перераспределение пигмента по всему глазному дну. Глазное дно ОД диск зрительного нерва бледно-розовый, миопический конус, границы четкие. Макулярные рефлексы стушеваны. По периферии перераспределение пигмента. Данные эхографии ПЗО-26.70 -26.79 Пк 3,51 3,43 3,84 3,84 деструкция стекловидного тела,дегенерация стекловидного тела,ОИ - патологических эхосигналов нет. Проведено молекулярно-генетическое исследование. Заключение выявлен генотип / альфа- цепи коллагена(Со 11 А 1). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ прогнозирования близорукости у детей,включающий исследование крови, отличающийся тем, что к исследуемой крови больного добавляют фенольно-хромосомные экстракты в стандартных дозировках, затем в полученный осадок добавляют олигонуклеотидные праймеры генов альфа-цепи коллагена, осадок разделяют путем электрофореза в 7 полиакриаламидном геле с последующим окрашиванием раствором бромистого этидия,результаты фиксируют на прибореи при выявлении генотипа /, прогнозируют развитие близорукости.