Способ культивирования ростковых клеток роговой оболочки

(51) С 12 5/08 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ использовано для создания культуры ростковых клеток роговой оболочки. Задача изобретения - разработка способа культивирования ростковых клеток роговой оболочки,обеспечивающего возможность длительного хранения полученной культуры. В качестве источника ростковых клеток используют биоптаты лимбальной зоны кадаверных донорских глаз, которые после предварительной обработки культивируют в питательной среде и после 6-8 пассажей вносят в коллагеновый гель из расчета 100-200 тыс. клеток на 1 мл геля с последующей инкубацией в течение 1 часа при 37 С. Жизнеспособность культуры ростковых клеток при культивировании предлагаемым способом составила 87 в течение 20 суток при температуре 6-8 С и 96 в течение 3 месяцев при температуре 10 С.(72) Ботабекова Турсунгуль Кобжасаровна Битов Нурзат Тынышбекович Кобцева Влада Юрьевна Наханов Азиз Куралбаевич Тлеубаев Касымхан Аблайханович(73) Республиканское государственное казенное предприятие Казахский ордена ЗНАК ПОЧЕТА научно-исследовательский институт глазных болезней Министерства здравоохранения Республики Казахстан(54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РОСТКОВЫХ КЛЕТОК РОГОВОЙ ОБОЛОЧКИ 21469 Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмотрансплантологии,и может быть использовано для создания культуры ростковых клеток роговой оболочки. Известен способ культивирования ростковых клеток роговой оболочки, заключающийся в том,что производят множественную биопсию лимбальной зоны донорского глаза, полученный материал помещают на плоских тарелках в культуральную среду, после инкубации в которой в течение нескольких дней получают культуру ростковых клеток роговой оболочки ( .// .- 2006.- . 11.-8.- .24.). Недостатки этого способа 1. Невозможность длительного хранения. 2. Трудоемкость трансплантации (полученная культура клеток имеет жидкую консистенцию). Известен также способ культивирования ростковых клеток роговой оболочки, избранный нами в качестве прототипа, заключающийся в том,что производят множественную биопсию лимбальной зоны донорского глаза, полученный материал помещают на амниотическую мембрану, а затем - в культуральную среду, после инкубации в которой в течение нескольких дней получают культуру ростковых клеток роговой оболочки на основе в виде амниотической мембраны ( -// .2007.- .12.-6, -.40.). Преимуществом данного способа по сравнению с предыдущим является лучшая возможность трансплантации, так как амниотическая мембрана, на которой выращены ростковые клетки роговицы, легко поддается пересадке и закреплению в глазу реципиента. Недостатком этого способа является невозможность длительного хранения полученной культуры клеток (срок хранения - не более 10 суток при температуре 6-8 С), что не позволяет создать ее достаточный запас и ограничивает возможности транспортировки. Задача изобретения - разработка способа культивирования ростковых клеток роговой оболочки,обеспечивающего возможность длительного хранения полученной культуры. Поставленная задача достигается тем, что биоптаты лимбальной зоны донорского глаза после предварительной обработки помещают в культуральную среду и согласно изобретению выращенную культуру клеток вносят в коллагеновый гель с последующей инкубацией. Способ осуществляют следующим образом. В качестве источника ростковых клеток используют биоптаты лимбальной зоны кадаверных донорских глаз. Исходный материал тестируют на сифилис,гепатит В и С, ВИЧ. Дополнительно для предотвращения микробной контаминации исходный биологический материал помещают в антибиотикосодержащие питательные среды на 4-5 часов, после чего биоптаты отмывают, инкубируют в среде Игла в течение 4 часов при 4 С, промывают раствором Хэнкса. Затем биоптаты измельчают,помещают в раствор коллагеназы и инкубируют при 40 С в течение 1 часа. Дезагрегацию клеток проводят в 0,25 растворе трипсина при 37 С в течение 1 часа. Полученную суспензию клеток центрифугируют при 800-1000 об/мин в течение 10 минут. Осадок культивируют в питательной среде при 37 С. Используют культуры клеток после 6-8 пассажей. После этого суспензию культивированных ростковых клеток лимба вносят в коллагеновый гель из расчета 100-200 тыс. клеток на 1 мл геля, после чего смесь подвергают инкубации в течение 1 часа при 37 С. Культуру ростковых клеток лимба в коллагеновом геле подвергают кратковременному(при 6-8 С) и долговременному (при температуре 10 С) хранению. Нами проведено определение жизнеспособности культуры ростковых клеток лимба в коллагеновом геле в различные сроки хранения при температуре 6-8 С и -10 С. Культура клеток считалась жизнеспособной, если мертвые клетки составляли не более 15. Результаты изучения жизнеспособности культуры ростковых клеток лимба в коллагеновом геле при кратковременном хранении при температуре 6-8 С отражены в табл. 1. Таблица 1 Жизнеспособность культуры ростковых клеток лимба в коллагеновом геле при кратковременном хранении при 6-8 С Сроки исследования Жизнеспособность клеток Из таблицы видно,что количество жизнеспособных клеток сохранялось достаточно высоким в течение 20 суток (87), что свидетельствует о возможности кратковременного хранения полученной культуры при 6-8 С. Определение жизнеспособности культуры ростковых клеток лимба в коллагеновом геле при долговременном хранении (-10 С) проводилось на 10 сутки, в 1, 2 и 3 месяц после получения культуры. Результаты изучения жизнеспособности культуры ростковых клеток лимба в коллагеновом геле отражены в табл. 2. 21469 Таблица 2 Жизнеспособность культуры ростковых клеток лимба в коллагеновом геле при долговременном хранении при -10 С Сроки исследования Жизнеспособность клеток Из таблицы видно,что количество жизнеспособных клеток к 3 месяцу хранения при температуре -10 С составило 96. Преимущество предлагаемого способа заключается в возможности долговременного хранения при температуре -10 С в течение 3 месяцев и кратковременного хранения при температуре 6-8 С в течение 20 дней без потери жизнеспособности культуры,что позволяет заблаговременно создать достаточный запас культивированных ростковых клеток роговицы,решив проблему дефицита и транспортировки донорского материала. Таким образом, жизнеспособность культуры ростковых клеток при культивировании предлагаемым способом составила 87 в течение 20 суток при температуре 6-8 С и 96 в течение 3 месяцев при температуре -10 С. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ культивирования ростковых клеток роговой оболочки,включающий получение биоптатов лимбальной зоны донорского глаза, их предварительную обработку и культивирование в питательной среде, отличающийся тем, что культуру клеток после 6-8 пассажей вносят в коллагеновый гель из расчета 100-200 тыс. клеток на 1 мл геля с последующей инкубацией в течение 1 часа при 37 С.