Штамм Pelecanus crispus/KZ/Almaty/94/2014 вируса болезни Ньюкасла, семейства Paramixoviridae рода Avulavirus, используемый в качестве контрольного штамма при производстве профилактических средств против болезни Ньюкасла

(51) 12 7/00 (2006.01) 61 39/17 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ ПРОИЗВОДСТВЕ ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ ПРОТИВ БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА///94/2014 вируса болезни Ньюкасла, семействародагенотип 7, предназначенный для приготовления отечественных иммунобиологических препаратов против болезни Ньюкасла. Изобретение относится к области вирусологии и представляет собой новый штамм вируса болезни Ньюкасла, репродуцированный на 10 суточных куриных эмбрионах (КЭ) с биологической и гемагглютинирующей активностью 8,50 ЭИД 50/2 см 3 соответственно. Тесты на бактериальную и грибковую контаминацию показали стерильность штамма в отношении бактериальных и грибковых микроорганизмов. Полученный штамм///94/2014 вируса болезни Ньюкасла депонирован в Коллекции микроорганизмов Республиканского государственного предприятия Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан (РГП НИИПББ КН МОН РК) под регистрационным номером М-23-15/и хранится в нативном виде при минус 70 С в криопробирках. Жизнеспособность штамма в стабильном состоянии поддерживается путем освежения на 10-суточных КЭ каждые 2 года.(72) Сансызбай Абылай Рысбайлы Орынбаев Мухит Бармаклы Рыстаева Рашида Аусекановна Султанкулова Куляйсан Турлыбаевна Керимбаев Аслан Амангелдиевич Копеев Сырым Калдыбаевич Строчков Виталий Михайлович Мусаева Гульжан Каленовна Омарова Замира Даулетызы Шалгынбаев Эльдар Кайратович Рябинникова Алена Игоревна Раметов Нуркуйса Мирзабекович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56)2482129 2, 20.05.20132482184 2, 20.05.2013 Репин П.И. и др. Биологические свойства изолятов вируса Ньюкаслской болезни, выделенных у голубей в Курской области // Научный журнал КубГАУ. 2013. 93(09), с.1-1083507 , 10.09.2013///94/2014 ВИРУСА БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА,СЕМЕЙСТВАРОДА ,ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ КОНТРОЛЬНОГО ШТАММА ПРИ Изобретение относится к области вирусологии и представляет собой новый штамм вируса болезни Ньюкасла (БН), который может быть использован для производства средств диагностики и профилактики, а также изучения биологии вируса. БН является одним из опасных заболеваний птиц, способным вызывать массовые падежи,причиняя огромный вред сельскому хозяйству и нанося серьезный экономический ущерб в связи с чем внесен в список наиболее важных патогенов(группы А по МЭБ). В настоящее время БН распространена в различных регионах мира. БН вызывается РНК-содержащим парамиксовирусом птиц 1 серотипа (ПМВ-1), относящийся к родусемейства . По данным, вирус БН способен инфицировать птиц, относящихся к 241 виду, что создает значительную экологическую нишу для его сохранения в природе. ПМВ-1 обладают широким спектром вирулентности,включая ассимптоматические варианты,а также низкопатогенные///94/2014 вируса БН получен от клинически здорового пеликана. Представленный штамм может быть использован для получения антигена вируса БН пригодного для постановки серологических реакций, для гипериммунизации животных с целью получения вирусспецифической сыворотки, получения вакцинного препарата, в качестве контрольного при производстве вакцин, а также для изучения биологии возбудителя и выявления особенностей циркуляции изменившихся с течением эволюции вариантов вирусов БН,циркулирующих в Казахстане. Задачей настоящего изобретения является получение нового казахстанского штамма вируса болезни Ньюкасла циркулирующего в популяции диких птиц. Сущность изобретения состоит в том, что впервые в Республике Казахстан в результате вирусологических исследований в июле 2014 г. на 10 суточных куриных эмбрионах (КЭ) выделен вирус БН из трахеального смыва дикой птицы Кудрявый пеликан, доставленный из озеро Алаколь Алматинской области. Из патологического материала, полученного от клинически здорового пеликана (селезенка, легкое, тонкий кишечник,головной мозг), был выделен изолят вируса БН,который получил название///94/2014. Вирус был выделен на РКЭ. Индикация вируса была проведена в РГА с эритроцитами петуха, но не агглютинировал эритроциты лошади показатели гемагглютинирующей активности составляли 1641128 ГАЕ/0,2 мл. Инфекционная активность выделенного вируса составляла 8,50 ЭИД 50/2 см 3(эмбриональная инфекционная доза). В настоящем изобретении представлены антигенные,биологические и молекулярногенетические свойства этого вируса. 2 После заражения РКЭ материалом от больной птицы максимальное накопление гемагглютинирующего агента с гибелью эмбрионов отмечено через 72 ч. Число пассажей к моменту паспортизации - 3. Штамм///94/2014 обладает биологическими характеристиками,позволяющими использовать этот вирус для специфического выявления РНК вируса БН с помощью ОТ-ПЦР,в конструировании рекомбинантных штаммов методом обратной генетики и разработке иммунобиологических препаратов(диагностических тест-систем,иммуноглобулина и вакцин), а также для оценки противовирусной активности различных лекарственных препаратов и новых соединений. Идентификация вируса. Первичная идентификация вируса осуществлялась методом ОТ-ПЦР с детекцией результатов в закрытой пробирке в режиме реального времени с использованием праймеров и зонда, специфичных к консервативным участкам М-гена вируса БН. Особенностями выделенного штамма являются Штамм///94/2014 вируса БН аналогов в Республике Казахстан не имеет. Проведенный филогенетический анализ данного штамма подтверждает, что данный штамм принадлежит к 7 генотипу. Известными штаммами вируса болезни Ньюкасла являются штамм///13/2008 выделенный из клинически здорового голубя и депонирован в коллекции культур микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии Вектор Роспотребнадзора под регистрационным номером -513. Штамм///13/2008 относится к 6 генотипу вируса БН. Штамм (26 иС) вируса БН, которые используются для создания диагностических сывороток (Патент США 6719979, МПК А 61 39/295, опубл. 13.04.2004), и штамм вируса болезни Ньюкасла 1 (.,, 1997, .1430-1433, . 15, 12/13),используемый также для создания диагностических сывороток. Наиболее близким аналогом (прототипом) являются штаммы вируса болезни Ньюкасла изолированных от погибшей утки при вспышке на территории республики Адыгея водного экологического комплекса на Северном Кавказе///15/2008). Штаммы относятся к 7 генотипу вируса БН. Силко Н.Ю., Глущенко А.В. и др.Биологические свойства велогенных штаммов вируса болезни Ньюкасла, изолированных от птиц на Северном Кавказе, . 1, 1979, Вопросы вирусологии, 1 том 58/2013 г, с.45-48. Вышеприведенные штаммы относятся к генотипу 2 и 6. Однако по причине антигенной дивергенции с наиболее опасными современными генетическими линиями (класс 2, генотип 7) точная диагностика и достоверная интерпретация результатов при использовании диагностических препаратов на основе сывороток,приготовленных с использованием вышеприведенных штаммов,затруднена. Техническим результатом настоящего изобретения является создание отечественного штамма вируса БН,антигенно близкого современным высокопатогенным штаммам вируса БН,которая позволяет получить высоко специфичные сыворотки для более точной диагностики вируса БН. Исследования показали, что представленный штамм относится к генотипу 7. По данным доступной литературы данный генотип эндемичен для стран Азии и Южной Африки. Известно, что эффективность профилактических мероприятий с использованием вакцинации зависит от штамма,используемого в составе вакцины. Чем ближе генетически штамм, используемый в составе вакцины, к циркулирующим на той местности вирусам тем эффективнее будут профилактические мероприятия. К тому же при использовании вакцины содержащим в своем составе соответствующий генотип вирусовыделение было значительно ниже, чем при использовании вакцин с несоотвествующим генотипом. Указанный технический результат достигается получением нового штамма вируса болезни Ньюкасла///94/2014 для приготовления средств диагностики и профилактики. Предлагаемое изобретение включает штамм,совокупность существенных признаков которого обеспечивает получение следующих технических результатов 1) высокая способность продуцироваться в КЭ выделен из аллантоисной полости 10-суточных КЭ через 48 ч. при 34 С после заражения. Изолированный вирус характеризовался титром 1128 ГАЕ. Инфекционный титр в КЭ через 72 ч. составил 8,50 ЭИД 50/2 см 3 2) контроль контаминации штамм не контаминирован микрофлорой,грибами,посторонними вирусами 3) способ хранения, в нативном виде. Эмбриональную вируссодержащую аллантоисную жидкость, разлитую в криопробирки замораживают при температуре минус 70 С. Молекулярно-генетические свойства штамма Генетический и филогенетический анализ Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности -гена, позволил отнести данный штамм к генотипу. Сайт протеолитического расщепления -гена представлен последовательностью 112 117 Патогенностъ для человека. Штаммы вируса болезни Ньюкасла не являются патогенными для человека. Патогенностъ для птицы. Штамм///94/2014 относится к умереннопатогенным вариантам вируса болезни Ньюкасла. Патогенностъ для млекопитающих. Штамм не проявляет патогенности для млекопитающих. Уникальные биологические свойства предлагаемого штамма обеспечивают технологическое преимущество по сравнению с другими, поскольку позволяют нарабатывать антиген высокого качества в большом количестве. Следует добавить, что предлагаемый штамм///94/2014 может быть использован совместно с другими известными для более детального исследования антигенных характеристик вновь выделяемых штаммов ВБН и серодиагностики сывороток крови животных. Выделенный штамм///94/2014 вируса болезни Ньюкасла депонирован и хранится в Депозитарии возбудителей особо опасных инфекций Республиканского государственного предприятия Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан с регистрационным номером -23-15/. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм///94/2014 вируса болезни Ньюкасла, семействарода , депонирован в Депозитарии возбудителей особо опасных инфекций РГП на ПХВ Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности КН МОН РК под номером М-23-15/, используемый в качестве контрольного штамма при производстве профилактических средств против болезни Ньюкасла.