Способ получения единого бруцеллезного антигена

(51) 61 39/10 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ 1 и 82 на эритрит-агаре с добавлением 0,02 цистина, 0,02 дрожжевого экстракта, 0,2 панкреатического гидролизата сои и гороха, 0,2 панкреатического гидролизата казеина,их выращивание, смыв выращенных культур стерильным 0,5-ным фенолизированным физиологическим раствором(рН 7,0-7,2),инактивацию полученных суспензий при температуре 80 С в течение 60 мин, с последующим смешиванием инактивированных суспензий бруцелл в соотношении 111, с последующей стабилизацией при 2-4 С в течение 10 дней и определением активности путем титрации в РА и РСК. Полученный антиген способен вступать в реакцию с более высоким количеством детерминантных групп- и- форм бруцелл, что приводит к повышению его чувствительности при диагностике бруцеллеза.(56) Касьянов А.Н. и др. Получение единого бруцеллезного антигена для РА, РСК, РДСК // Ветеринария, 1973,10, с. 50-52(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЕДИНОГО БРУЦЕЛЛЕЗНОГО АНТИГЕНА(57) Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии, и может быть использовано при приготовлении препаратов для диагностики бруцеллеза. Способ получения единого бруцеллезного антигена включает рассев бруцеллезных культур штаммов 19,24838 Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии, и может быть использовано при приготовлении препаратов для диагностики бруцеллеза. Известен способ получения бруцеллезного антигена, включающий выращивание бруцелл на плотной питательной среде, смыв выращенной культуры стерильным 0,5-ным фенолизированным физиологическим раствором,инактивацию полученной суспензии нагреванием, стабилизацию при 2-4 С в течение 10 дней и определение активности, при этом в качестве бруцелл используют штамм(А.Н.Касьянов и др. Получение единого бруцеллезного антигена для РА, РСК, РДСК // Ветеринария.-1973.-10, с. 50-52). Однако этим способом получают антигены,реагирующие, в основном только с антителами,преимущественно гомологичными к детерминантным группам этого вида микроба. Задача изобретения повышение чувствительности антигена. Задача решается тем,что антиген представляет собой смесь (111) взвеси культур штамма 19,- 1 и 82. Технический результат повышение активности и специфичности конечного продукта. Способ получения единого бруцеллезного антигена включает рассев бруцеллезных культур штаммов 19,1 и 82 на эритрит-агаре с добавлением 0,02 цистина, 0,02 дрожжевого экстракта, 0,2 панкреатического гидролизата сои и гороха, 0,2 панкреатического гидролизата казеина,их выращивание, смыв выращенных культур стерильным 0,5-ным фенолизированным физиологическим раствором(рН 7,0-7,2),инактивацию полученных суспензий при температуре 80 С в течение 60 мин, с последующим смешиванием инактивированных суспензий бруцелл в соотношении 111, с последующей стабилизацией при 2-4 С в течение 10 дней и определением активности путем титрации в РА и РСК. 1. Техника получения антигена. Бруцеллы вакцинного штамма 19, раздельно, вакцинного штамма 1, и раздельно, вакцинного штамма 82 высевают на эритрит-агаре с добавлением 0,02 цистина, 0,02 дрожжевого экстракта, 0,2 панкреатического гидролизата сои и гороха, 0,2 панкреатического гидролизата казеина,помещенную в посевную емкость. Посев культуры производят путем увлажнения питательной среды посевным материалом, для чего используют 2 суточную агаровую культуру бруцелл. Засеянные емкости помещают в термостат при температуре 37 С на 48 часов. После окончания выращивания культуру смывают стерильным 0,5-ным фенолизированным физиологическим раствором с рН 7,0-7,2. Смытую культуру сливают и инактивируют при 80 С в течение 60 минут. 2 Прогретую суспензию проверяют на чистоту путем микроскопии мазков, окрашенных по Грамму и Козловскому и высева на МПБ, МПА, печеночномартеновский агар и бульон с переваром Хоттингера, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро по две пробирки и два флакона с 50 см 3 бульона на каждый образец. За высевами наблюдают в течение 10 дней. Далее осуществляют смешивание инактивированных суспензий бруцелл штаммов 19,- 1 и 82 в соотношении 111, с последующей стабилизацией при 2-4 С в течение 10 дней и определением активности путем титрации в РА и РСК. 2. Определение активности антигенов. Активность антигена в РА стандартизируют по национальной стандартной агглютинирующей сыворотке антиабортус, содержащей в 1 см 3 1000 международных единицантител. Содержимое ампулы (сухую стандартную сыворотку) растворяют дистиллированной водой, а затем разводят 0,5 ным фенолизированным физиологическим раствором 1150, 1200, 12540, 1300 и 1350. Полученные разведения сыворотки хранят в стерильных флаконах. Концентрат антигена разводят 0,5-ным фенолизированным физиологическим раствором 13 13,5 14 и т.д. до 116. Каждое разведение антигена испытывают со всеми пятью разведениями стандартной сыворотки при одинаковой дозировке ингредиентов, равной 0,5 см 3. При этом после добавления антигена к сыворотке в каждой пробирке будет по 1 мл смеси,соответствующей конечным разведениям сыворотки 1300, 1400, 1500, 1600, 1700. Одновременно антиген испытывают с негативной сывороткой в разведении 125, 150 и 0,5-ным фенолизированным физиологическим раствором. Пробирки встряхивают, выдерживают в термостате при температуре 37 С в течение 23 ч и затем при комнатной температуре 1 ч. Реакцию агглютинации учитывают в соответствии с наставлением по постановке и учету РА при диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных. При учете определяют то разведение антигена,которое с конечным разведением стандартной сыворотки 1500 дает 50 агглютинации . С негативной сывороткой и физиологическим раствором реакции должны быть отрицательными. В зависимости от результатов титрации концентрированную суспензию разводят стерильным 0,5-ным фенолизированным раствором и тщательно смешивают. Отбирают пробу и ставят РА с разведениями антигена 14,5 15 15,5. Антиген в разведении 15 с конечным разведением стандартной агглютинирующей сыворотки 1500 должен дать 50 агглютинации. Активность антигена в РСК определяют титрованием по квадратной схеме со стандартной бруцеллезной агглютинирующей сывороткой в разведениях 150, 1100, 1125, 1150, 1175, 1200. Одновременно антиген испытывают с негативной сывороткой в разведениях 15 и 110. Антиген(стандартизированную, а РА взвесь бруцелл) разводят 150, 1100, 1150, 1200, 1300, 1400. Комплемент и гемолизин берут в рабочих титрах,эритроциты 2,5 от осадка. Сыворотку инактивируют 30 минут при температуре 58-60 С. Предельным титром антигена считают то его разведение, которое дает полную задержку гемолиза с наибольшим разведением стандартной бруцеллезной сыворотки. За рабочий титр антигена в РСК принимают двойную дозу его предельного титра. Антиген выпускают, если в РА его разведение 15 с конечным разведением стандартной бруцеллезной сыворотки 1500 дает 50 агглютинациив РСК - дает полную задержку гемолиза со стандартной бруцеллезной сывороткой в ее предельном титре при разведении антигена не ниже чем 1150. 3. Изучение активности единого антигена. При проведении производственного испытания единого бруцеллезного антигена полученного из трех штаммов бруцелл, для сравнения использовали единый бруцеллезный,изготовленный по существующей методике. Сыворотку исследовали в серологических реакциях агглютинации (РА) и связывания комплемента (РСК). Исследования проводили на животных неблагополучных по бруцеллезу хозяйств, а также в благополучных хозяйствах. Всего было подвергнуто исследованию 145 сывороток крови от крупного рогатого скота, 60 - от свиней, 217 - от мелкого рогатого скота. Полученные при этом данные приведены в таблице 1. Таблица 1 Результаты испытания активности и специфичности предлагаемого бруцеллезного антигена в сравнении с существующим антигеном Вид животных Благополучие Хозяйства по бруцеллезу Количество Результаты Результаты исследования в исследованных исследования в РА РСК проб Существующая Предлагаемая Существую- Предлагаесывороток щая мая Неблагополучное 78 12 14 14 16 Крупный рогатый скот Свиньи Неблагополучное 26 Мелкий Неблагополучное 143 рогатый скот Крупный Благополучное 67 рогатый скот Свиньи Благополучное 34 Мелкий Благополучное 74 рогатый скот Как видно из данных таблицы 1, в результате проведенных испытаний установлена высокая активность и специфичность антигена, содержащего три штамма бруцелл, при этом значительное повышение чувствительности антигена наблюдали при диагностике бруцеллеза у овец (повышение выявляемости в среднем на 20 ). Таким образом, полученный антиген способен вступать в реакцию с более высоким количеством детерминантных групп-и- форм бруцелл что приводит к повышению его чувствительности при диагностике бруцеллеза. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения единого бруцеллезного антигена, включающий выращивание бруцелл на плотной питательной среде, смыв выращенной культуры стерильным 0,5-ным фенолизированным физиологическим раствором,инактивацию полученной суспензии нагреванием, стабилизацию при 2-4 С в течение 10 дней и определение активности отличающийся тем, что в качества бруцелл используют штаммы 19,-1 и 82,выращенные на эритрит-агаре с добавлением 0,02 цистина, 0,02 дрожжевого экстракта, 0,2 панкреатического гидролизата сои и гороха, 0,2 панкреатического гидролизата казеина, а единый антиген получают путем смешивания инактивированных суспензий бруцелл в соотношении 111, с последующей стабилизацией при 2-4 С в течение 10 дней и определением активности путем титрации в РА и РСК.