Скачать PDF файл.

Формула / Реферат

Изобретение относится к областиветеринарии, в частности к вирусологии, а именнок способам диагностики вирусных инфекций. Вспособе выявления антигенов вируса болезниНьюкасла твердофазный иммуноферментный анализантигенсодержащего биологического материалаосуществляют нанесением точечно нанитроцеллюлозную мембрану исследуемых образцов,инкубируют полученный иммуносорбент сконъюгатом специфических антител к антигенамвируса болезни Ньюкасла с пероксидазой хрена ивыявляют ферментативную активностьмодифицированным раствором субстрата,содержащим 1 мг/мл бензидина, 0,3 мМ Твин 20, 0,01 %раствор ионов Со и Ni и 0,03 % раствор перекисиводорода, и по выявлению четко очерченных темныхпятен судят о наличии антигенов вируса болезниНьюкасла. Предложенный способ имеет высокуючувствительность и специфичность при детекцииантигена вируса болезни Ньюкасла, позволяетосуществлять диагностику без применениядорогостоящей аппаратуры и сократить времяисполнения анализа в 4 раза.

Текст

Смотреть все

КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к области ветеринарии,в частности к вирусологии, а именно к способам диагностики вирусных инфекций. В способе выявления антигенов вируса болезни Ньюкасла, твердофазный иммуноферментный анализ антигенсодержащего биологического материала осуществляют нанесением точечно на нитроцеллюлозную мембрану исследуемых образцов, инкубируют полученный иммуносорбент с конъюгатом специфических антител к антигенам вируса болезни Ньюкасла с пероксидазой хрена и выявляют ферментативную активность модифицированным раствором субстрата, содержащим 1 мг/мл бензидина,0,3 мМ Твин 20, 0,01 раствор ионов Со ии 0,03 раствор перекиси водорода и по выявлению четко очерченных темных пятен судят о наличие антигенов вируса болезни Ньюкасла. Предложенный способ имеет высокую чувствительность и специфичность при детекции антигена вируса болезни Ньюкасла, позволяет осуществлять диагностику без применения дорогостоящей аппаратуры и сократить время исполнения анализа в 4 раза.(72) Тустикбаева Гульнур Булановна Богоявленский Андрей Павлинович Березин Владимир Элеазарович Толмачева Валентина Петровна Левандовская Светлана Викторовна Худякова Светлана Сергеевна(73) Республиканское государственное казенное предприятие Институт микробиологии и вирусологии Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ ВИРУСА БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА 14497 Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к вирусологии, а именно к способам диагностики вирусных инфекций. Известен способ выявления антигенов вируса болезни Ньюкасла в клинических образцах с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. 1991, . 34, . 13-26). Способ заключается в том, что для выявления антигенов вируса болезни Ньюкасла используют биотинилированные моноклональные антитела с последующим добавлением авидина, меченого ферментом, и флюорогенного субстрата. Дорогостоящие реагенты, используемые в известном способе, ограничивают его применение в практических ветеринарных учреждениях. Известен способ выявления антигенов вируса болезни Ньюкасла с помощью дот варианта твердофазного иммуноферментного анализа (. ,К.С. , ,-(-)// . .,1999, . 37,10, . 1037-1038). Способ заключается в том, что для выявления антигенов вируса болезни Ньюкасла используют моноклональные антитела кбелку. Несмотря на высокую чувствительность и специфичность, способ имеет ограниченное применение в практических ветеринарных учреждениях, так как требует дорогостоящей аппаратуры для постановки анализа, сложно приготавливаемых реагентов и реактивов, имеющих краткие сроки хранения. Задачей изобретения является разработка высокочувствительного и экономичного способа антигенов вируса болезни Ньюкасла для практического применения в ветеринарных лабораториях. В способе выявления антигенов вируса болезни Ньюкасла твердофазный иммуноферментный анализ антигенсодержащего биологического материала осуществляют нанесением точечно на нитроцеллюлозную мембрану исследуемых образцов, инкубируют полученный иммуносорбент с конъюгатом специфических антител к антигенам вируса болезни Ньюкасла с пероксидазой хрена и выявляют ферментативную активность модифицированным раствором субстрата, содержащим 1 мг/мл бензидина,0,3 мМ Твин 20, 0,01 раствор ионов Со ии 0,03 раствор перекиси водорода, и по выявлению четко очерченных темных пятен судят о наличие антигенов вируса болезни Ньюкасла. Способ осуществляют следующим образом. Пример 1. Описание способа. Для осуществления реакции точечного иммунного связывания (ИФА-ТИС) используют нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 0,2-1,2 мкм. Аликвоты исследуемых образцов наносят микропипеткой на нитроцеллюлозную мембрану в количестве от 1 до 8 мкл. Для удаления 2 несвязавшегося антигена мембрану отмывают физиологическим раствором. Полученный иммуносорбент блокируют обработкой буферного раствора, содержащего инертный белок и поверхностно-активное вещество, в течение 30-45 мин при 37 С. Антигены вируса болезни Ньюкасла выявляют с использованием конъюгата специфических к исследуемым антигенам антител с пероксидазой хрена. Рабочее разведение конъюгата (1/100-1/400) готовят на буферном растворе, содержащем инертный белок и поверхностно-активное вещество. После инкубации иммуносорбента с конъюгатом несвязавшиеся антитела отмывают буферным раствором, содержащим поверхностно-активное вещество. Ферментативную метку выявляют с помощью комплексообразующего субстрата бензидина. Раствор субстрата содержит 1 мг/мл бензидина, 0,3 мМ Твин 20, 0,01 комплекс ионов Со ии 0,03 перекиси водорода. Учет результатов проводят визуально. Положительная реакция проявляется в виде четко очерченных темных пятен. При отрицательной реакции изменений в окраске иммуносорбента не происходит. Пример 2. Влияние типа мембраны на чувствительность метода точечной иммуносорбции. В исследованиях изучали влияние типа мембраны на чувствительность метода точечной иммуносорбции. Результаты визуальной детекции вирусного антигена, иммобилизованного на мембраны различной химической природы, отражены в табл. 1. Как видно из приведенных в таблице данных,чувствительность метода не зависит от типа мембран при нанесении антигена в объеме 2-4 мкл на пятно и составляет 2-4 нг/мл. Увеличение объема наносимого антигена приводит к увеличению диаметра пятна, что неудобно при диагностике большого числа образцов. Так, при нанесении 8 мкл образца диаметр пятна составляет - 12 мм, 16 мкл - 24 мм,32 мкл - 40 мм и т.д. Пример 3. Влияние длительности инкубации иммуносорбента с конъюгатом специфических антител к ВБН и пероксидазой хрена на чувствительность предлагаемого способа. Длительность инкубации иммуносорбента с пероксидазным конъюгатом влияет на чувствительность метода. Как показано в табл. 2, уменьшение длительности инкубации менее 30 мин приводит к уменьшению титра антигена, регистрируемого в ИФА-ТИС. Увеличение длительности инкубации больше 30 мин не сказывалось на титре антигена. Поэтому оптимальной длительностью инкубации иммуносорбента с пероксидазным конъюгатом специфических к ВБН антител является 30 мин. Пример 4. Сравнение предлагаемого способа определения антигенов ВБН со стандартными способами определения антигенов ВБН. Для сравнительного изучения предлагаемого способа определения антигенов ВБН со стандартными способами определения антигенов ВБН были использованы различные патологические материалы цыплят (трахеальные и клоакальные смывы, желудок и легкие), экспериментально зараженных ВБН, штамм. 14497 В ходе исследований (табл. 3) было установлено,что чувствительность ИФА-ТИС превышает чувствительность стандартного ИФА в 2-4 раза и превышает чувствительность стандартного метода РГА более, чем на 2 порядка. Таким образом, предложенный способ, ИФАТИС на мембранном сорбенте, обладает чувствительностью, превышающую чувствительность стандартных способов диагностики антигенов ВБН Таблица 1 Влияние типа полимерного сорбента на чувствительность ИФА-ТИС Подложка Чувствительность метода (в нг/мл) в зависимости от объема наносимого антигена 2 мкл 4 мкл 8 мкл 0,2240,6 20,6 0,50,15 40,6 20,6 10,3 0,4540,6 20,6 0,250,04 0.65 40,6 20,6 10,3 0,2240,6 20,6 20,6 0.45 Владипор 0,540,6 20,6 20,6 Таблица 2 Зависимость активности и специфичности реакции ИФА-ТИС от длительности инкубации иммуносорбента с пероксидазным коньюгатом Длительность инкубации ИФА-ТИС (прямой метод) 1 2 5 1200 6,2,0 10 1800 8,2,0 15 11600 9,2,0 30 11600 9,2,0 45 11600 9,2,0 60 11600 9,2,0 Примечание 1-обратные титры разведения антигена, 2-геометрические титры Таблица 3 Сравнительное изучение чувствительности различных способов диагностики антигенов ВБН РГА ИФА ИФА-ТИС 1 8 256 512 2 8 256 512 3 2 32 64 4 2 32 128 5 8 128 256 6 8 128 512 7 2 16 32 8 16 512 1024 9 2 32 128 10 2 16 32 Примечание даны обратные титры разведения антигена Предложенный способ по сравнению с существующими иммуноферментными системами на твердой фазе для выявления антигена ВБН имеет более высокую чувствительность и специфичность при ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ детекции антигена ВВН и позволяет осуществлять диагностику без применения дорогостоящей аппаратуры и сократить время исполнения анализа в 4 раза. муносорбента с конъюгатом специфических антител к антигенам вируса болезни Ньюкасла с пероксидазой хрена и выявлением ферментативной активности модифицированным раствором субстрата, содержащим 1 мг/мл бензидина, 0,3 мМ Твин 20, 0,01 раствор ионов Со ии 0.03 раствор перекиси водорода, и по выявлению четко очерченных темных пятен судят о наличии антигенов вируса болезни Ньюкасла. Способ выявления антигенов вируса болезни Ньюкасла путем твердофазного иммуноферментного анализа антигенсодержащего биологического материала, отличающийся тем, что твердофазный иммуноферментный анализ осуществляют нанесением точечно на нитроцеллюлозную мембрану исследуемых образцов, инкубацией полученного имВерстка Молдахметова Д.А. Корректор Хамзина Т.М.

МПК / Метки

МПК: G01N 33/545

Метки: выявления, ньюкасла, болезни, способ, вируса, антигенов

Код ссылки

<a href="https://kz.patents.su/3-14497-sposob-vyyavleniya-antigenov-virusa-bolezni-nyukasla.html" rel="bookmark" title="База патентов Казахстана">Способ выявления антигенов вируса болезни Ньюкасла</a>

Похожие патенты