Комбинированная вакцина на основе поверхностного антигена вируса гепатита В, способ ее получения и способ предупреждения гепатита В у человека

(51)7 61 39/295, 61 39/29,61 39/39 ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(73) СМИТКЛАЙН БИЧЭМ БАЙОЛОДЖИКАЛС С.А. (ВЕ)(54) КОМБИНИРОВАННАЯ ВАКЦИНА НА ОСНОВЕ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА В, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ГЕПАТИТА В У ЧЕЛОВЕКА(57) Описаны стабильные и эффективные поливалентные вакцины, содержащие поверхностный антиген гепатита В , в которых компонент устойчив в течение недели при 37 С и обладает высокой иммуногенностью, например, при назначении младенцам. Обычно в состав вакцины входит, адсорбированный на фосфате алюминия, и другие антигены, особенно те, которые относятся к детским вакцинам, адсорбированные на фосфате алюминия или гидроксиде алюминия. Описаны также методы получения вакцин и использование фосфата алюминия для стабилизациив поливалентной вакцине. 13474 Настоящее изобретение относится к новейшим технологиям получения вакцин, методике их приготовления и их использованию при лечении. В частности, настоящее изобретение относится к новейшей технологии приготовления комбинированной вакцины, включая в качестве компонента вакцину от гепатита В для лечения инфекций гепатита . Инфицирование вирусом гепатита В (НВ) - это широко распространенная проблема, но, что касается вакцины, которая может быть применена для массовой иммунизации, сейчас это доступно, например, продукт Энгерикс В (). Энгерикс В имеет поверхностный антигенный компонент гепатита В , который получен с помощью современной генной инженерии. Тем не менее, часто необходимо или желательно назначать вакцину гепатита В наряду с другими вакцинами, и это может быть связано с необходимостью многочисленных инъекций. Проблемы, связанные с многочисленными инъекциями, включают более сложную процедуру управления вакцинацией и большим объемом вводимых в организм лекарств. Таким образом, существует необходимость в комбинированной вакцине, содержащей антиген гепатита В в сочетании с другими антигенами. Другими антигенами, в частности, являются те из них,которые могут использоваться в составлении вакцин для профилактики гепатита А (НА), дифтерии (Д),столбняка (С), цельноклеточного коклюша (Кц),бесклеточного коклюша (Ка), эпидемического гриппа б (Н) и полиомиелита (П). Гидроксид алюминия (АГ) широко применяется как адъювант при приготовлении вакцины. Например, в Энгериксе В используется поверхностный антиген гепатита В , адсорбированный гидроокисью алюминия. Мы также успешно применяли гидроксид алюминия в технологии приготовления вакцины как против гепатита А, так и комбинированных вакцин АДС, АКцДС и АКаДС. Тем не менее, когда адсорбированный на гидроксиде алюминияприменяется в сочетании с другими вакцинами в вакцине с комбинированным формульным составом, имеет место существенное снижение иммунного ответа на воздействия , проявляющееся в меньшей или недостаточной серопрофилактики после введения вакцины. В дополнение, устойчивость компонентав комбинированной вакцине низка., адсорбированный на фосфате алюминия,может применяться в выпускаемой для продажи одновалентной вакцине , производимой фирмой Мы установили, что нет существенных различий между иммуногенными характеристиками одновалентной вакцины , адсорбированной на А-, и одновалентной вакциной , адсорбированной на АФ. Публикация Европейской патентной заявки 0339667 раскрывает двухвалентную вакцину, содержащуюи антиген гепатита А, в которой гидроксид алюминия или фосфат алюминия используются как адъювант. Тем не менее, нет необходимости недооценивать гидроксид алюминия в качестве адъюванта для получения поливалентной вакцины, содержащей. Более того, есть основания полагать, что ни в этом документе, ни где-либо еще нет описания двухвалентной или поливалентной вакцины гепатита В, в которой, по крайней мере, один антиген, иной чем , адсорбируется на гидроксиде алюминия иадсорбируется на фосфате алюминия. И действительно оказывается, что ранее не было опубликовано позволяющее повторить полученные результаты описание стабильной и эффективной поливалентной вакцины, содержащей . В одном из аспектов настоящее изобретение представляет комбинированную вакцину, содержащую поверхностный антиген гепатита Ви ряддругих антигенов в сочетании с адъювантом,содержащим одну или более солей алюминия, в которой(ых) значение количестваравно 1 или более и в которых адъювант, используемый для адсорбирования , не является гидроксидом алюминия, при условии, что если 1, то другой антиген не является антигеном против гепатита А. Предпочтительно 2, 3, 4, 5 или 6. Преимущество данного изобретения состоит в том, что не наблюдается существенного снижения иммуногенности , имеющей место в случае применения вакцин с комбинированным формульным составом. Отказ от использования АГ для адсорбции- компонента позволяет получить продукт значительно более высокой стабильности. Дальнейшее преимущество этого изобретения состоит в том, что ранее рассмотренные проблемы, связанные с множественными инъекциями, преодолеваются или, по крайней мере, смягчаются, и в распоряжение медицины предоставляется стабильный и высокоиммуногенный препарат. Компоненты данного изобретения, в частности,подходят для назначения детям. Преимущественно поверхностный антиген гепатита Вадсорбируется на фосфате алюминия (АФ). В частности, в ходе клинических исследований с участием людей мы обнаружили, что, когда адсорбированный на АФкомбинируется с одним или более адсорбированных на Г или АФ антигенов в комбинированной вакцине, существенного снижения иммуногенности не происходит. Стойкость , адсорбированного на АФ, в этом препарате также выше, чем в случае , адсорбированного на АГ. Соответственно, в следующем аспекте обеспечивается получение состава вакцины по данному изобретению, в котором, по крайней мере, один из антигенов, иной чем , адсорбируется на фосфате алюминия. Следующим преимуществом является то, что, по крайней мере, один из антигенов, иной чем ,адсорбируется на АГ. 13474 Следующий аспект заключается в том, что это изобретение обеспечивает получение комбинированной вакцины, содержащей антиген гепатита В, адсорбированный на АФ или антиген, адсорбированный на АФ или на АГ, отделенный от антигена, обеспечивающего иммунитет от одного или более следующих вирусов дифтерии (Д), столбняка (С), коклюша (К), инактивированного полиомиелита (ИПВ), эпидемического гриппа Ви гепатита А (НА). В вакцину для детей могут включаться другие совместимые антигены, причем антигены известны как эффективное средство против менингита В, менингита А и С и отитов. Примененный здесь термин двухвалентный используется для описания вакцины, имеющей в своем составе всего два антигена (включая ). Термин поливалентный применяется к вакцине, состав которой содержит более двух антигенов, например, 3, 4, 5 или 6 антигенов. Значение терминов фосфат алюминия и гидроксид алюминия, примененных здесь, включает все формы гидроксида алюминия или фосфата алюминия, которые подходят в качестве адъюванта Например, фосфат алюминия может быть осадком (аморфным, полукристаллическим или кристаллическим), который может быть получен любым способом, а не только способом смешивания растворимых алюминиевых и фосфорных солей. Гидроксид алюминия может быть осадком нерастворимого (аморфного, полукристаллического или кристаллического) гидроксида алюминия, который может быть получен любым способом, но не исключительно способом нейтрализации растворов солей алюминия. В частности, подходят различные формы гелей гидроксидов алюминия и фосфата алюминия,поставляемых по коммерческим каналам, например,Альгидрогель (гидроксид алюминия, 3 водный раствор) и Адьюфос (фосфат алюминия, 2 солевой раствор), предложенный фирмой(, 2950 ). Будет ценным, что для начала мы можем получать стабильную и эффективную поливалентную вакцину, содержащую . Соответственно, следующим аспектом изобретения является обеспечение стойкого и эффективного состава комбинированной вакцины, предназначенного для предотвращения более чем двух заболеваний, содержащих , и, по крайней мере, два других антигена. Что касается выбора адъюванта, прекрасные результаты были получены, когдабыл адсорбирован на АФ и, по крайней мере, один из антигенов, иных чем , адсорбирован на АГ. Можно использовать другие подходящие адъюванты. Например, один или все антигены, иные чем ,мгут быть адсорбированы на АФ. Предпочтительные сочетания вакцины в соответствии с предметом изобретения(АКДС-НВ),дифтерия - столбняк - гепатит В (АДС-НВ),АКДС-ИПВ (инактивированная полиомиелитная вакцина)-гепатит В. Будет ценно, что для вакцины, содержащей Нкомпонент, -антиген может использоваться, если он будет вводиться в состав назначаемого препарата непосредственно перед употреблением. В этом случае могут быть приготовлены следующие сочетания компонентов вакцины в соответствии с предметом изобретения, например- гепатит В,АКДС- - гепатит. В,ИПВ-АКДС- - гепатит В. Более специфичными вакцинами в соответствии с предметом изобретения являются дифтерия - столбняк - коклюш (АКДС, адсорбированная на АГ или на АФ) - гепатит В (,адсорбированный на АФ) дифтерия - столбняк (АДС, адсорбированная на АФ или на АГ)-гепатит В (, адсорбированный на АФ). В соответствии с предметом изобретения, под термином стойкая здесь описывается вакцина, которая может храниться при температуре 37 С в течение одной недели без существенных потерь иммуногенности компонента поверхностного антигена гепатита В . Используемый здесь термин эффективность относится к такой вакцине, в которой иммуногенностьв комбинированной вакцине находится на уровне, когда геометрическое среднее (по результатам титрования), равное, по меньшей мере, 200 мМЕ/мл (миллимеждународных единиц в одном миллилитре), преимущественно 300 мМЕ/мл или больше, обнаруживается в организме ребенка месяц спустя после введения третьей дозы вакцины, применяемой с месячным интервалом на основании соответствующего плана вакцинации. В следующем аспекте данное изобретение обеспечивает получение поливалентной по составу вакцины, содержащейи стабилизирующий адъювант, выбранный таким образом, что вакцина может храниться при температуре 37 С в течение одной недели без каких-либо существенных потерь иммуногенности компонента . Предпочтительно состав поливалентной вакцины далее характеризуется возрастанием геометрического среднего значения титрования, по крайней мере, до 200 мМЕ/мл (один месяц после инъекции), лучше 300 мМЕ/мл или более, обнаруживается в организме ребенка месяц спустя после введения третьей дозы вакцины, применяемой с месячным интервалом на основании соответствующего плана вакцинации. В том значении, в каком используется в данном документе, термин соответствующий план вакцинации означает известный специалистам в данной области знаний график и величину доз вакцинации,особенно назначаемых детям. В качестве примера 3 13474 может использоваться план вакцинации, рассчитанный на 3, 4 и 5 месяцев. Это, в частности, свойственно для вакцин, содержащих КДС-, согласно изобретению. В одном из аспектовможет быть адсорбирован на соли алюминия, иной чем гидроксид алюминия. Преимущественно это соединение адсорбируется к АФ. Другие антигены в данной технологии получения поливалентной вакцины могут быть адсорбированы на АФ или АГ (или на обеих солях) и преимущественно адсорбированы на АГ, как показано на нижеследующих примерах. Преимущественно, формульный состав вакцины,согласно предмету изобретения, представлен вакциной от коклюша. Коклюшный компонент является цельноклеточной коклюшной вакциной или бесклеточной коклюшной вакциной, содержащей частично или высокоочищенные антигены. Вышеназванные комбинации могут (но не обязательно) включать компонент, который является защитой от гепатита А, т.е. антиген . Преимущественно, гепатит В - комбинированная вакцина против гепатита В - это вакцина, предназначенная для детей. Приготовление антигенов и процесс адсорбции с адъювантами хорошо известны в данной области знаний. См. нижеприведенные примеры. Приготовление поверхностного антигена гепатита Вхорошо известно. См. например, (1983), . , 54, 125, (1987)5,479,- 226 846,- 299 108 и ссылки к ним. В том виде, в каком используется в данном документе, термин поверхностный антиген гепатита В иливключает любой антигенили его фрагмент, воспроизводящий антигенность поверхностного антигена . Далее будет понятно,что в дополнение к последовательности из 226 аминокислот антигена(см. статью Тьоллайса и др., журнал Нэйчур, с. 317, т. 489, 1935) и ссылки на нее), антиген(в том виде, в каком описан в данной работе) может, при желании, содержать всю или часть предпоследовательности, как описано в вышеприведенных ссылках и в Европатенте ЕР А-0278 940. В частности, антигенможет содержать полипептид, содержащий аминокислотный ряд, в составе которого аминокислотные остатки 12-52, следующие за остатками 133-145, за которыми следуют остатки 175-400 в цепи -протеина антигена гепатита В , относительно к открытой рамке считывания вируса гепатита В серотипа(этот полипептид обозначается каксм. ЕР 0414374). В рамках данного изобретенияможет также включать пред 1-пред 2- полипептид,описанный в ЕР 0193 474 (Эндотроникс) или его аналоги, такие как описанные в ЕР 0304 578 .в том виде, в каком описан в данном документе, может также относиться к 4 мутантам, например утекающий мутант, описанный в 91/14703 или Европейском патенте 0511855 , особенно , где замещение аминокислоты в позиции 145 - это аргинин из глицина. Обычноможет существовать в виде частичек. Частички могут представлять собой, например, один только -протеин или могут быть составными частичками, например (, ), гдесоответствует вышеприведенному описанию,обозначает-протеин . Выгодным обстоятельством является то, что указанная частичка существует в том виде, в каком она выражена в дрожжах. Подходящие антигены для использования в вакцинах в соответствии с предметом изобретения уже коммерчески доступны, а более подробная информация может быть получена из ВОЗ. Например, компонент может быть инактивированной полиомиелитной вакциной . Вакцина от коклюша может содержать цельноклеточный продукт или бесклеточный продукт, или продукт, полученный рекомбинантным образом. В частности, коклюшный. компонент может быть КТ (коклюшный токсин) или его субфракциями,(нитевидный гемагглютининовый антиген), агглютиногены (фимбриальные) или протеины с внешней мембраной, включая протеин 69 (пертацин, нефимбриальный агглютиноген). Литература , ., ,,56, 1988, 3189-3195. Компонент, обеспечивающий защиту от гепатита В - это преимущественно продукт, известный под названием Хаврикс (о), который представляет собой убитую ослабленную вакцину, полученную из штамма НМ 175 вируса гепатита(см. Инактивированные возможные вакцины против гепатита А, авторы , .и (1980),. . . . 37, р. 72-95 и монография,посвященная продукту Хаврикс, опубликованная компанией(1991). Флемиг и др. (там же, р. 56-71) освещает клинические аспекты, вирусологию, иммунологию и эпидемиологию гепатита А и рассматривает подходы к разработке вакцин против обычных вирусных инфекций. В том виде, в каком используется здесь, термин антиген НА относится к любому антигену, способному стимулировать нейтрализующие антитела к НА у людей. Этот антиген НА содержит в себе инактивированные ослабленные частички вируса или может быть, например, капсидомили вирусным белком НА, который может быть обычным образом получен с помощью рекомбинантной технологии ДНК. Приготовление вакцины описано, в основном, в книге Новые тенденции и разработки в области, , Количество антигена в каждой дозе вакцины выбирается как количество, которое вызывает иммунозащитную реакцию без существенных отрицательных побочных эффектов, характерных для типичных вакцин. Такое количество будет варьироваться в зависимости от того, какие конкретно иммуногены задействованы. В основном, предполагается, что в каждой дозе содержится 1-1000 мкг общего иммуногена, предпочтительно 2-100 мкг, более предпочтительно 1-40 мкг и наиболее предпочтительно 15 мкг. Оптимальное количество для этой специфической вакцины может быть установлено с помощью обыкновенного исследования, связанного с наблюдением титров антител или других реакций-ответов организмов. Курс первичной вакцинации может включать 2 или 3 дозы вакцины, таким образом, с промежутком один-два месяца), следуя рекомендациям ВОЗ для АКДС-иммунизации. Таким образом, изобретение обеспечивает способ профилактики гепатита В и других инфекций у людей, особенно у детей, который включает в себя лечение человека при необходимости иммунологически эффективной дозой. вакцины в соответствии с любым аспектом данного изобретения, как описано выше. Другим аспектом изобретения является использование вакцинной композиции в медицине. В дальнейшем аспекте изобретения обеспечивается применениедля производства комбинированной вакцины в соответствии с содержанием данного изобретения для профилактики гепатита В и вирусных заболеваний. В следующем аспекте изобретения обеспечивается применение АФ с целью стабилизирующего воздействия на и/или для поддержания эффективностив поливалентной вакцине в соответствии с изобретением. Специфично, что данное изобретение обеспечивает применение фосфата алюминия для приготовления стойкой комбинированной вакцины, содержащейи, по крайней мере, один другой антиген (предпочтительно, по крайней мере, два других антигена), благодаря чему стабильность и/или иммуногенность -компонента выше, чем в соответствующей комбинированной вакцине, в которой -компонент адсорбирован на АГ. Еще более специфично, что это изобретение обеспечивает такое применение вакцины, благодаря которому вакцина может содержаться при 37 С в течение недели (т.е. 7 дней) без существенных потерь иммуногенности . Также в данном изобретении заявляется такое использование вакцины, благодаря которому геометрическое среднее результатов титрования (ГСТ),полученных спустя 1 месяц после введения третьей дозы в ходе вакцинации детей с одномесячными интервалами на основании соответствующего плана вакцинации, обнаруживается концентрация вакцины выше 200, но преимущественно выше 300 мМЕ/мл. В дальнейшем аспекте настоящего изобретения описывается способ производства комбинированной(двухвалентной или поливалентной) вакцины, эффективной для профилактики инфекции гепатита В,как проиллюстрировано в примерах ниже. В другом предпочтительном аспекте антигены,иные чем , адсорбируются на АГ. Этим способом может быть получена очень эффективная вакцина АКаДС - гепатит В. В целом, комбинированные вакцины с составами, соответствующими любому из аспектов данного изобретения, могут быть приготовлены следующим образом. Требуемые ДС, КцДС, КаДС, НА или другие компоненты адсорбируются на подходящем адъюванте, особенно на АФ или АГ поверхностный антиген гепатита Вадсорбируется на подходящем стабилизирующем адъюванте, выбранным так, как это описывалось выше, особенно на соли алюминия, иной чем АГ. Предпочтительно он адсорбируется на АФ. После времени, отводимого для завершения и стабилизации адсорбции соответствующих компонентов, различные компоненты комбинируются в соответствующих условиях. Должно быть принято во внимание, что определенные компоненты, например ДС, КцДС и КаДС компоненты могут быть скомбинированы отдельно,прежде чем будет добавлен адсорбированный компонент . Поливалентные вакцины, содержащие , и другие дополнительные относительно тех, что упомянуты выше, антигены могут быть приготовлены подобным же образом. В предпочтительном аспекте обеспечивается способ приготовления комбинированной вакцины с составом, соответствующим изобретению, где этот способ заключает в себе смешивание адсорбированного на фосфате алюминияодним или большим числом адсорбированных на гидроксиде алюминия или фосфате алюминия антигенов. Следующие примеры иллюстрируют изобретение. ПРИМЕРЫ 1-5 Технологии Конкретные составы вакцин по настоящему изобретению были приготовлены, как описано ниже. Пример 1. Адсорбцияна АРО 4 для приготовления комбинированной вакцины Суспензия фосфата алюминия, содержащая от 0,03 до 0,3 г алюминия (в виде фосфата алюминия) в изотоническом солевом растворе, смешивается с концентратом , содержащим 10 мг белка, в конечном объеме от 10 до 100 мл. После доведения рН до 5-6,5 смесь оставляется на 10-24 часа при комнатной температуре в смесителе. Затем к смеси может быть добавлен антисептик (т.е. мертиолат, от 120.000 до 110.000 или 2-феноксиэтанол, от 3 до 6 мг/мл), и объем доводится до 50 мл с помощью изотонического солевого раствора. 13474 Пример 2. Приготовление комбинированной вакцины, против дифтерии-столбняка-гепатита В Концентрат, содержащий 25.000 Лф токсоида дифтерии и 10.000 Лф токсоида столбняка, адсорбированных на 0,35 г(в виде гидроксида алюминия или фосфата алюминия), приготовляется в конечном объеме 0,15 л изотонического солевого раствора, его кислотность рН доводится до значения между 6 и 7,как определено ВОЗ для АДС и АКДС-вакцин. Этот концентрат комбинируется с 0,05 л концентрата гепатита В, по примеру 1. Эта смесь доводится до окончательного объема 0,5 л с помощью добавления изотонического солевого раствора. Антисептические среды (мертиолат в соотношении от 120.000 до 010.000 или 2 феноксиэтанол, от 3 до 6 мг/мл) могут быть добавлены при необходимости. Конечное значение рН должно быть в диапазоне от 6 до 7, как установлено ВОЗ для АДС и АКДС-вакцин. Одна 0,5 мл доза этой нефасованной вакцины содержит в качестве активных ингредиентов Д токсоид 25 Лф,С токсоид 10 Лф, 10 мкг протеина. Эта процедура может быть изменена с целью использования больших или меньших количеств активных ингредиентов. Пример 3. Получение комбинированной вакцины против дифтерии-столбняка-коклюша (цельноклеточная вакцина)-гепатита В. В том виде, в каком поступает с предприятия В концентрат, содержащий 7.500 Лф дифтерийного токсоида, 3.250 Лф столбнячного токсоида и 15.000 единиц объема антигенакоклюша,адсорбированных на 0,45 мг А (в виде гидроксида алюминия или фосфата алюминия), приготовляется в конечном объеме 0,4 л изотонического солевого раствора, а его кислотность доводится до значения 6-7, как рекомендовано ВОЗ для АКДС вакцин. Этот концентрат комбинируется с 0,05 л концентрата гепатита В по примеру 1. Эта смесь доводится до конечного объема 0,5 л с помощью изотонического раствора. Могут быть добавлены антисептические среды (мертиолат, от 120.000 до 010.000 или 2-феноксиэтанол, от 3 до 6 мг/мл). Конечное значение рН должно быть между 6 и 7, как установлено ВОЗ для АДС и АКДС вакцин. Одна доза 0,5 мл этой нефасованной вакцины содержит в качестве активных ингредиентов Д токсоида 7,5 Лф,С токсоида 3,25 Лф,Кц антигена 150 Ед, 10 мкг протеина. Эта процедура может быть изменена с целью использования больших или меньших количеств активных ингредиентов. Пример 4. Получение вакцины против дифтериистолбняка-коклюша (бесклеточный компонент) Концентрат, содержащий 25.000 Лф дифтерийного токсоида и 10.000 Лф столбнячного токсоида,6 адсорбируется на 0,35 г А (в виде геля гидроксида алюминия или фосфата алюминия) и приготавливается в конечном объеме 0,15 л изотонического раствора, а его кислотность рН доводится до уровня между 6 и 7, как рекомендовано ВОЗ для АДС и АКДС вакцин. Добавляются 25 мг инактивированного коклюшевого токсина (АКаДС), 25 мг нитевидного гемагглютининаи, при необходимости, 8 мг белка с наружной мембраной 96 (пертактина), каждый из которых смешивается с 0,05 г А (в виде гидроксида алюминия или фосфата алюминия). Антигены В коклюша КТ, НА и пертактин могут быть приготовлены с применением известных в данной области знаний способов, см. например,заявку на получение Европейского патента 427462,РСТ заявку 91/12020, или других процедур,дающих физиологически приемлемые и сильнодействующие В коклюшные антигены. Эта смесь доводится до конечного объема 0,5 л с помощью изотонического солевого раствора. Антисептические среды (мертиолат, от 120.000 до 010.000 или 2-феноксиэтанол, от 3 до 6 мг/мл) могут быть добавлены при необходимости. Конечное значение рН доводится до уровня между 6 и 7, как рекомендовано ВОЗ для АДС и АКДС вакцин. Одна 0,5 мл доза этой нефасованной вакцины содержит в качестве активных ингредиентов Д токсоид 25 Лф,С токсоид 10 Лф,Д токсоид 25 мкг,НА токсоид 25 мкг,69 ОМР 8 мкг (необязательный). Эта процедура может быть изменена с целью использования больших или меньших количеств активных ингредиентов. Пример 5. Получение комбинированной вакцины против дифтерии-столбняка-коклюша (бесклеточный компонент)-гепатита В Может быть применена технология приготовления, описанная в примере 4, за исключением того,что дополнительные 50 младсорбированного концентрата, приготовленного по примеру 1, добавляются к конечной смеси. Полученная смесь доводится до конечного объема 0,5 л с помощью изотонического солевого раствора. Антисептические среды (мертиолат, от 120.000 до 010.000 или 2-феноксиэтанол, от 3 до 6 мг/мл) могут быть добавлены в случае необходимости. Конечное значение рН - между 6 и 7, как установлено ВОЗ для АДС и АКДС вакцин. Одна доза 0,5 мл этой нефасованной вакцины содержит в качестве активных ингредиентов Д токсоид 25 Лф,С токсоид 10 Лф,К Т токсоид 25 мкг, токсоид 25 мкг,69 ОМР 8 мкг (необязательный). 13474 Эта процедура может быть изменена с целью использования больших или меньших количеств активных ингредиентов. ПРИМЕРЫ 6-10 Исследования на животных и людях Пример 6. Получение комбинированных вакцин против гепатита А-гепатита В Концентрат инактивированного вируса гепатита А (460,000 единиц по- ферментный иммуносорбентный тест), адсорбированный на 0,02-0,2 г,предпочтительно 0,04-0,1 г, алюминия (в виде гидроксида алюминия), в конечном объеме более 125 мл был смешан с 50 мл концентрата, содержащего 10 мг , адсорбированного на фосфате алюминия, как описано в примере 1. К полученной смеси был добавлен изотонический солевой раствор и концентрат аминокислоты(,-) до получения конечного объема 0,5 л, содержащего 1,5 г аминокислот. Конечное значение рН было между 6 и 7. Наш 1 мл дозы этого объема нефасованной вакцины содержит в качестве активных ингредиентов антиген вируса гепатита А 800 ед. по ЕА, 20 мкг белка. Эта процедура может быть изменена с целью использования больших или меньших количеств активных ингредиентов. РЕЗУЛЬТАТЫ Клинические исследования, где сравниваются(моновалентной вакцины), адсорбированные на гидроксиде алюминия (АГ) и фосфате алюминия(АФ). Первоначально серонегативные здоровые взрослые добровольцы были иммунизированы 3 дозами по 20 мкг -белка, прививаемыми с месячным интервалом. Уровни антител были определены в сыворотке, взятой через месяц после 2-й и 3-й доз с использованием теста Осаба (Эббота). Ответные реакции были определены, как число субъектов, результаты титрования для которых значительно выше фоновых. Результаты титрования выражаются в мМЕ/мл. Результаты выражены как геометрическое среднее титров (ГСТ) в мМЕ/мл. Месяц спустя Месяц спустя 2 2 3 3 геом. сред.участников геом. ср. тит уч. титрования рования 32 86 141 100 26 93 198 98 30 84 147 93 43 83 380 100 14 82 126 98 15 83 110 98 17 83 133 96 18 96 270 98 14 90 156 96 Пример 7. Тесты на иммуногенность мышей и результаты ускоренных тестов на стабильность для комбинированных вакцин, содержащих в качестве адъювантас гидроксидом алюминия (АГ) или фосфатом алюминия (АФ) Группы по 10 мышей с антигенным маркером Обыли иммунизированы подкожно 2 дозами по 2,5 мкг(однокомпонентным или комбинированным) в нулевой и 14-й дни. Кровь была взята на 21 день и была подвергнута титрованию на содержание антитела гепатита и с использованием теста Осаба (Эббота). Титры антител были подсчитаны в мМЕ/мл. Количество реагирующих животных было определено как количество тех, у которых уровни антител значительно превышали общий фон. Было также вычислено геометрическое среднее значение результатов титрования (ГСТ). Результаты АДС-НВ,АКцДС-НВ, АКаДС-НВ показали, что , адсорбированная на АФ, действует лучше, чем ,адсорбированная на АФ, как с точки зрения числа продемонстрировавших ответную реакцию животных, так и с точки зрения значений ГСТ. Ответная реакция , адсорбированной на АФ, в сочетании с другими соединениями сравнима с той, что имела место в случае назначения моновалентного . Пример 8. Иммуногенность антигена ,скомбинированного с АКцДС, у обезьян Результаты применения антигена, адсорбированного на гидроксиде алюминия (АГ) и фосфате алюминия (АФ). Зеленые мартышки получили по 2 инъекции по 10 мкг(одного или комбинированного) на 0 й и 30-й дни эксперимента. Сыворотка взята на 30-й день и 57-й день, титрована (Осаб, Эббот) на содерВакцина Энгерикс В (НВ) (АГ) АКцДС (АГ) НВ (АГ) АКцДС (АГ) НВ (АФ) После 2-й инъекции на 57-й день число респондентов ГСТ 5/5 666 5/5 31 5/5 414 значительно выше общего фона. Показатель защиты(в процентах) относится к субъектам с результатами титрования равными или большими,чем 10 мМЕ/мл. ГСТ подсчитано в мМЕ/мл. Результаты для АКцДС-НВ показали, что, адсорбированные на АФ, дают удовлетворительную реакцию в противоположность , адсорбированным на АГ. Интенсивность сероконверсии и ГСТ были сравнимы с данными, типично наблюдаемыми в случае моновалентной вакцины(Энгерикс В). участников Время взятияреспондентовзащищенных(субъектов) крови на анализ АКцДС (АГ) НВ (АГ) 32 После 2-й нд нд После 3-й 94 84 АКцДС (АГ) НВ (АФ) 29 После 2-й 97 97 17 После 3-й 100 100 инъекции Пример 10. Иммуногенность и стойкость ,адсорбированного на гидроксиде алюминия (АГ) или фосфате алюминия (АФ) в комбинированной вакцине против гепатита А и гепатита В Группы по 10 мышей с антигенным маркером О были иммунизированы подкожно двумя дозами по 2,5 мкг(однокомпонентными или комби 8 жание анти-. Животные с уровнем антител значительно выше общего фона (предварительная вакцинация сыворотки) считались реагирующими. Геометрическое среднее значение результатов титрования было подсчитано в мМЕ/мл. Результаты показали, что , адсорбированный на АФ,действует лучше, чем , адсорбированный на АГ. Реакция была сравнена с той, что имела место в случае назначения моновалентного . После 1-й инъекции на 30-й день число респондентов ГСГ 4/5 10 4/5 20 5/5 12 Пример 9. Клинические исследования с применением комбинированных вакцин АКцДС с использованием , адсорбированного на гидроксиде алюминия (АГ) или фосфате алюминия (АФ) Субъектам были привиты 3 дозы по 0,5 мл, содержащие АКцДС и 10 мкг -белка и имеющие возраст 3, 4 и 5 месяцев. Взятие крови на анализ было произведено на 6-м месяце, и сыворотка была титрована с использованием теста Осаба. Показатель процента респондентов (с сероконверсией) относится к субъектам, у которых уровень антител нированными) в 0-й и 14-й дни. Кровь была взята на анализ на 21-й день и протитрована на содержание антигеном , как показано в примере 7. Результаты иммуногенности и стойкости НА-НВ комбинированного продукта показали, что ,адсорбированные на АФ, дают более высокие уровни антител и имеют более стабильную форму. Пример 11. Результаты дальнейших клинических испытаний на людях 1. Иммуногенность АКцДС-гепатит В вакцины у младенцев Эксперимент А Исследования в Словакии режим прививок 3-4-5 месяцев, 10 мкгАКцДС, поступающий с предприятия(ДС на АГ Кц на смеси АГ и АФ) Результаты титрования на содержание анти-Нвадъювант Гидроксид Гидроксид Фосфат Фосфат В этом и других примерахозначает - после 2-й дозы,- после 3-й дозы. ГСТ всегда измеряется через месяц после момента инъекции, ГСТ 45 34 80 396 Результаты титрования на содержание антител против дифтерии, столбняка, В-коклюша После 3 результатов Антидифтерийная Антистолбнячная Анти В-коклюшевая Эксперимент Б Исследования в Греции режим прививок 2-4-6 месяцев (та же вакцина, как в эксперименте А) Результаты (промежуточные) титрования на содержание анти адъювант Гидроксид Гидроксид Фосфат Эксперимент В Исследования в Словакии режим прививок 3-4-5 (5 мкг на фосфате алюминия АКцДС, поступающий с предприятия , как в эксперименте А) Результаты титрования на содержание анти -Время ПослеПосле 13474 Эксперимент Г Исследования в Словакии режим прививок 3-4-5 месяцев по возрасту (10 мкг на фосфате алюминия АКцДС, поступающий с предприятия , как в эксперименте А) Результаты титрования на содержание анти-НВ Время До После(мес.5) После(мес. 6) Противодифтерийные антитела Время До ПослеПосле Провивостолбнячные антитела Время До ПослеПосле 2. Иммуногенность АКаДС-гепатит В вакцины у младенцев Эксперимент А Исследования в Турции- 10 мкг на АФ АКДС (бесклеточная) на АГ. Предварительные результаты. Группа 1 (комбинация АКаДС-Энгерикс В) Время До ПослеПослеПосле Группа 2 (АКаДС плюс Энгерикс В отдельные одновременные инъекции) Время До ПослеПослеПосле Обозначения- число тестируемых субъектов- кол-во субъектов, сероположительных при сдаче крови в определенное время- коэффициент сероконверсии и ГСТ - геометрическое среднее значение результатов титрования на содержание анти 10 тел у участников, демонстрирующих сероконверсию.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Комбинированная вакцина на основе поверхностного антигена вируса гепатита В, отличающаяся тем, что она содержит поверхностный анти 13474 ген вируса гепатита В, адсорбированный на фосфате алюминия, и антигены других патогенов в количествеот одного до шести, причем если 1, то антиген не является антигеном вируса гепатита А. 2. Вакцина по пункту 1, отличающаяся тем, что содержит, по крайней мере, один изантигенов других патогенов, адсорбированный на фосфате алюминия. 3. Вакцина по пункту 1, отличающаяся тем, что содержит, по крайней мере, один изантигенов других патогенов, адсорбированный на гидроокиси алюминия. 4. Вакцина по пункту 1, отличающаяся тем, что из антигенов других патогенов она содержит антигены возбудителей дифтерии, столбняка, коклюша,эпидемического гриппаи/или вирусного гепатита А. 5. Вакцина по пункту 1, отличающаяся тем, что содержит антигены патогенов гепатита В, дифтерии, столбняка и коклюша или гепатита В, дифтерии и столбняка. 6. Вакцина по пунктам 3 или 4, отличающаяся тем, что из антигенов коклюшного патогена она содержит цельноклеточную коклюшную вакцину или очищенную бесклеточную вакцину. 7. Способ получения комбинированной вакцины по пунктам 1-6, в котором поверхностный антиген вируса гепатита В адсорбируют на фосфате алюминия, отличающийся тем, что заключает в себе смешивание адсорбированного на фосфате алюминия поверхностного антигена вируса гепатита В с одним или более антигенами, адсорбированными на гидроокиси алюминия или фосфате алюминия. 8. Способ предупреждения гепатита В у человека путем вакцинации, отличающийся тем, что включает в себя введение пациенту, нуждающемуся в подобном лечении, эффективной дозы вакцины по любому из пунктов 1-6.