Способ получения гербицидоустойчивых трансгенных растений хлопчатника сорта “Туркистан”

(51) 01 1/00 (2006.01) 12 15/12 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ хлопчатника,позволяющий получать 100 стерильных семян, что дает возможность получать асептические проростки для работы в культуре, создана рекомбинантная плазмида 7,содержащая гены фосфинотрицинацетилтрансферазы и глюкуронидазы, изучен взаимосвязанный эффект между концентрацией ацетосирингона, оптической плотности суспензии бактерий и временем ко-культивация для определения оптимальных параметров- опосредованной трансформации эксплантов, проведен мониторинг транзиентной экспрессии генау эксплантов, селекция трансформированных клеток и тканей хлопчатника в культурес помощью фосфинотрицина,достигнута регенерация трансформированных растений из апикальных меристем и пазушных почек и проведен молекулярный анализ растенийтрансформантов. Использование данного способа позволяет получить генетически измененные гербицидоустойчивые растения хлопчатника,которые будут востребованы сельскохозяйственными учреждениями Республики Казахстан. Таким образом решить проблему сорных растений, уменьшить время и частоту обработки полей и, тем самым, снизить экологическую нагрузку на окружающую среду. Дальнейшее включение гербицидоустойчивых растений в селекционный процесс приведет к созданию гербицидоустойчивых сортов и гибридов.(72) Манабаева Шуга Аскаровна Рахимжанова Айжан Осербаевна Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Ертаева Б., Амирова А., Шаяхметова И.,Бишимбаева Н. Оптимизация условий агробактериальной трансформации хлопчатника. Серия естественных технических наук, 2010.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕРБИЦИДОУСТОЙЧИВЫХ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ХЛОПЧАТНИКА СОРТА ТУРКИСТАН(57) Изобретение относится к селекции и биотехнологии растений, в частности генной инженерии. Изобретение может быть использовано для получения генетически модифицированных растений хлопчатника сорта Туркистан. Технической задачей изобретения являлось получение трансгенных гербицидоустойчивых растений хлопчатника сорта Туркистан с помощью-опосредованной трансформации. При решении технической задачи разработан эффективный метод стерилизации семян Изобретение относится к селекции и биотехнологии растений, в частности генной инженерии. Изобретение может быть использовано для получения генетически модифицированных гербицидоустойчивых растений хлопчатника. В Казахстане хлопчатник (.) является важной технической сельскохозяйственной культурой,имеющей экспортное значение,возделывается в Южно-Казахстанской области. Хлопок занимает второе место после зерна в объеме экспорта сельскохозяйственной продукции страны. Одной из основных проблем сельскохозяйственного производства является борьба с сорняками. Вред от сорных растений многообразен, они заглушают культурные растения,поглощая из почвы большое количество воды и питательных веществ, выделяя при этом из корней в почву вредные вещества. Вс это снижает урожай, а в ряде случаев приводит к гибели посевов. Объемы производства и применения гербицидов постоянно растут, так как им отводится важная роль в совершенствовании агротехники. Однако широкое применение гербицидов в сельском хозяйстве для борьбы с сорной растительностью выдвигает проблему биологического контроля над физиологически активными веществами, которые могут неблагоприятно воздействовать на биологическую активность почвы и ее микрофлору. При этом многие гербициды оказывают воздействие не только на сорняки, но и на растения, для защиты которых их используют. Таким образом, существует проблема защиты хозяйственно-ценных культур от неблагоприятного воздействия на них гербицидов. С помощью традиционной селекции вывести устойчивые сорта растений весьма сложно. В частности,не существует сортов сельскохозяйственных растений, толерантных к наиболее широко используемым гербицидам. Для решения этой проблемы могут быть созданы трансгенные растения, обладающие устойчивостью к этим химическим препаратам. Генетически измененные растения с устойчивостью к различным классам гербицидов в настоящее время являются наиболее успешным биотехнологическим продуктом. Создание устойчивых к гербицидам сортов и гибридов позволяет решить проблему сорных растений,уменьшая время и частоту обработки полей и, тем самым, снижает экологическую нагрузку на окружающую среду. В Казахстане одним из наиболее широко применяемых гербицидов для борьбы с однолетними и многолетними сорняками является глюфосинат аммония (фосфинотрицин,коммерческие названия - Баста, Либерти и Финал). В мире более 20 различных видов растений были трансформированы либо геномизс,либо геном(РАТ). Фермент РАТ,синтезируемый в клетках растения под контролем генови , обеспечивает устойчивость к гербициду глюфосинату аммония ( С., . .,В. ..2-//. - 2005. . 41. - . 134-149.). Глюфосинат аммония обладает контактным и локально-системным действием, усваивается зелеными частями растения и ингибирует активность фермента глутаминсинтетазы. Это приводит к накапливанию в клетке токсичного соединения - аммиака,вызывающего ее гибель. Растение, в которое введен этот ген, обладает способностью продуцировать фосфинотрицин-ацетилтрансферазу,что катализирует -ацетилирование гербицида в растительной клетке, и таким образом, обеспечивает устойчивость растения к глюфосинату. Среди способов генетической трансформации наиболее эффективным и надежным считается введение чужеродных генов с помощью. При этом чужеродные гены, как правило, стабильно интегрируются и передаются от поколения к поколению согласно законам Менделя. Первые работы по агробактериальной трансформации хлопчатника были начаты в 80-х годахвека (, ., , ., , .А., , 1987.(.) . / 5263266.). Однако возможности этого метода были ограничены, поскольку только из небольшого количества сортов хлопчатника можно индуцировать соматический эмбриогенез и регенерацию растений в культуре клеток. Также большинство коммерческих сортов хлопчатника, включая и основные казахстанские сорта, не относятся к легко трансформируемым. Несколько позже с помощью биобаллистической трансформации была трансформирована эмбриогенная суспензионная культура клеток элитных сортов хлопчатника (, . Е.,/ 11,596-598.). Эксперименты п агробактериальной трансформации стали возможны после долгих лет оптимизации протоколов для некоторых сортов хлопчатника. В качестве реципиентных систем для агробактериальной трансформации хлопчатника обычно используют вегетативные органы - семядоли, гипокотили( С.,, - //. - 1999. - . 98. - . 252-256.) или эмбриогенные каллусные ткани ( Т.,.. - 2010. -. 101. - . 323330.). Однако, несмотря на усилия по созданию единой методики трансформации такая эффективная система трансформации для различных генотипов(сортов) до сих пор не создана. При необходимости получения модифицированных растений трудно трансформируемых коммерческих сортов хлопчатника приходится проводить оптимизацию протоколов морфогенеза и регенерации для каждого генотипа. Аналог изобретения. В рамках исследования данного проекта проведен информационнопатентный поиск в сетина получения генетически модифицированных растений обладающих признаком устойчивости к фосфинитрицин - содержащим гербицидам, в том числе к глюфосинату аммония. Известные способы получения трансгенного хлопчатника с помощью, описанный в патенте 50048632 и биобаллистической трансформации,описанный в статье , С. ., . , . . , Т. Е. . 1995... . . 13(1)31-37. Способы трансформации клеток хлопчатника и развития из таких клеток растений,устойчивых к гербицуду описаны в заявке на патент 122200 из клеток суспензионных культур хлопчатника, а также в заявке на патент 20030132242 -из тканей хлопчатника. Недостатком этих способов являются,что разработанные способы трансформации растений в культуре клеток и тканей хлопчатника ограничиваются лишь одним сортом 312, который не являются коммерчески важным. Нами не найдены работы по созданию гербицидоустойчивых растений хлопчатника сортов казахстанской селекции полученные с помощью агробактериальной трансформации. Наиболее близким к предложенному является получение генетически модифицированных растений хлопчатника казахстанского сорта Мактаарал-4005,экспрессирующих ген бетаин альдегиддегидрогеназы(Ертаева Б., Амирова А.,Шаяхметова И., Бишимбаева Н. Оптимизация условий агробактериальной трансформации хлопчатника// Поиск. Серия естественных и технических наук, 2010. (3). - С.59-63.). Данная методика не является эффективной для хлопчатника сорта Туркистан. Процесс регенерации и трансформации растений являются генотип зависимыми, то есть эффективность и возможность получения положительного результата во многом определяются самим генотипом (в данном случае сортом). Из этого следует, что для достижения эффективности необходимо заново подобрать условия регенерации растений и агробактериальной трансформации для каждого конкретного сорта(генотипа). Задачей изобретения является получение трансгенных гербицидоустойчивых растений хлопчатника сорта Туркистан. Отличие предлагаемого нами способа получения трансгенных гербицидоустойчивых растений хлопчатника сорта Туркистан заключается в генетической трансформации сегментов апикальных меристем и пазушных почек хлопчатника сорта Туркистан методом ко-культивирования с., несущий рекомбинантную плазмиду 7,содержащей гены фосфинотрицинацетилтрансферазы и глюкуронидазы, и в последующей регенерации трансгенных растений,имеющих внесенные гены. Технический результат, который может быть достигнут с использованием данного метода трансформации получение трансгенных гербицидоустойчивых растений хлопчатника сорта Туркистан посредством совокупности операции стерилизация семян и получение 100 стерильных проростков, создание рекомбинантной плазмиды 7,содержащей ген фосфинотрицинацетилтрансферазы и репортерный ген -глюкуронидазы,изучение взаимосвязанных эффектов между концентрацией ацетосирингона,оптической плотности суспензии бактерий и временем ко-культивации для определения оптимальных параметров опосредованной трансформации эксплантов,мониторинг транзиентной экспрессии генау эксплантов, селекция трансформированных клеток и тканей хлопчатника в культурес помощью фосфинотрицина, регенерация трансформированных растений из апикальных меристем и пазушных почек и молекулярный анализ растенийтрансформантов. Достижения технического результата позволят решить проблему сорных растений, уменьшить время и частоту обработки полей и, тем самым,снизить экологическую нагрузку на окружающую среду. Дальнейшее включение гербицидоустойчивых растений в селекционный процесс приведет к созданию гербицидоустойчивых сортов и гибридов, также в перспективе получать принципиально новые формы растений хлопчатника, применяя эту технологию и конструкции, содержащие полезные гены,например, гены устойчивости к насекомымвредителям, засолению и засухе. Осуществление изобретения. Пример 1. Получение асептического растительного материала Для получения асептического растительного материала проводят обеззараживание семян хлопчатника с применением стерилизующих агентов - 70 этилового спирта и 10 раствора гипохлорита натрия. Перед стерилизацией семена промывают под проточной водой около 8 часов, и очищают от линта (волокнистый покров семян,оставшийся после отделения хлопка волокна от семян хлопчатника). Затем семена, очищенные от 3 линта, обрабатывают в растворе 70 этилового спирта в течение 5 минут, затем промывают 3-4 раза стерильной дистиллированной водой. После, семена помещают в 10 раствор гипохлорита натрия с добавлением 1-2 капли Твина-20. Время экспозиции составляет 20 минут при постоянном перемешивании, затем промывают в течение 30 минут (3-4 раза меняют воду) стерильной водой. Стерильные семена хлопчатника (3-4 семян в один бокс) высаживают в боксы маджента, содержащие 50 мл безгормональной среды МС ( Т., .//. - 1962. - . 15. - . 473-497.) с 30 сахарозой, 0,2 фитогелем, и проращивают в течение 14 дней. Достигшие 7-10 см в высоту растения извлекают из бокса в асептических условиях и используют для агробактериальной трансформации. Пример 2. Создание бинарной плазмиды Для оптимизации протокола агробактериальной трансформации хлопчатника предпочтительно использовать вектор, содержащий репортерный ген,что облегчает проведение мониторинга экспрессии генов на начальных этапах экспериментов. Поэтому проведен дизайн генно-инженерной конструкции,экспрессирующей ген фосфинотрицинацетилтрансферазы и репортерный ген -глюкуронидазы под растительными промоторами на базе двух существующих бинарных векторов 7 и . В состав Т-ДНК бинарного вектора 7 входит оптимизированный для экспрессии в растениях ген, кодирующий синтез фосфинитрицинацетилтрансферазы(РАТ),встроенный под конститутивным промотором 35 вируса мозаики цветной капусты. Ген , обеспечивающий устойчивость к гербициду Баста, состоит из 552 пар нуклеотидов. Бинарный векторсодержит репортерный ген , кодирующий синтез глюкуронидазы под убиквитиновым промотором кукурузы. Нуклеотидная последовательность репортерного генапредставлена 1812 парами оснований. Для создания генно-инженерной конструкции, содержащей гены фосфинитрицинацетилтрансферазы и -глюкуронидазы, исходные бинарные векторы были клонированы и выделены плазмидные ДНК. В качестве матрицы, используя бинарный векторамплифицирована экспрессионная кассета,включающая в себя убиквитиновый промотор кукурузы, репортерный гени терминатор Т с помощью следующих праймеров прямой 5- 3 обратный 5 3 содержащих сайты рестрикций . ПЦР-продукт длиной 3905 п.н. был разрезан с помощью рестриктаз , очищен из 1 агарозной гели и в последующем клонирован (лигирован) по сайтамв разрезанный бинарный вектор 7. В результате получен новый бинарный вектор 7, 4 содержащий гены фосфинотрицинацетилтрансферазы и глюкуронидазы (фиг.1). Пример 3. Выбор штамма Для проведения экспериментов по агробактериальной трансформации хлопчатника сорта Туркистан используют штамм .4404, ЕНА 105 и 0. Однако, штамм 4404 явялется наиболее подходящим для трансформации эксплантов хлопчатника сорта Туркистан, чем ЕНА 105 и , поскольку при использовании пару последних наблюдается неконтролируемый рост бактерий на селективной среде. Неконтролируемый рост бактерий на селективной среде приводит к некрозу эксплантов. Поэтому в дальнейшем для проведения экспериментов по агробактериальной трансформации хлопчатника сорта Туркистан используют штамм 4404 Этот штамм содержит -плазмиду (4404), у которой Т-ДНК делетирована, но сохранены интактные области 5. Пример 4. Подготовка штамма Трансформация клеток 4404 . с бинарным растительным вектором 7,содержащий гены фосфинотрицинацетилтрансферазы и глюкуронидазы проводится с помощью электропорации. Трансформированную смесь выращивают в жидкой питательной среде без антибиотиков в течение 2 часов при 28 С. Полученную суспензию центрифугируют, полученный осадок клеток агробактерий с 7 высаживают на твердую селективную среду с канамицином (100 мг/л) и рифампицином (12,5 мг/л), культивируют при 28 С в течение 2-х дней в термостате. Клоны анализируют на наличие рекомбинантной плазмиды с помощью ПЦР. Результат ПЦР позволяет отобрать трансформированные колонии агробактерий,содержащийген (1375 р) (фиг.2). В итоге,полученный штамм . , несет бинарную плазмиду 7, содержащую ген фосфинотрицинацетилтрансферазы и репортерный ген -глюкуронидазы,который используется для- опосредованной трансформации эксплантов хлопчатника. Пример 5.- опосредованная трансформация апикальных меристем и пазушных почек хлопчатника с бинарным растительным вектором 7 После скрининга колоний .на наличиегена, штамм 4404 . ,несущий бинарную плазмиду 7 используют для трансформации. Подготовку штамма . 4404 проводят следующим образом засевают штамм . 4404 штрихом на питательную среду , содержащей селективные антибиотики рифампицин и спектиномицин в концентрациях 25 мг/л и 100 мг/л и культивируют в течение 2-3 суток при 28 С. Первый день трансформации Ночную культуру агробактерий выращивают в 5 мл жидкой среды,дополненной соответствующими селективными антибиотиками рифампицином и спектиномицином в концентрациях 25 мг/л и 100 мг/л, на качалке (200 об/мин) в течение 12 часов при 28 С до необходимой оптической плотности (ОП 0,3 до 0,6). Бактериальные клетки осаждают центрифугированием (3000 об/мин, 10 мин), осадок бактериальных клеток промывают в 5 мл, 10 мМ раствора О 4 и центрифугируют (3000 об/мин, 10 мин). Осадок ресуспендируют в 10 мл преиндуцирующей среды, содержащей соли среды АВ(4 - 20 г/л, О 472 - 6 г/л, КС - 3 г/л,СаС 22 Н 2 О - 0,264 г/л, 472 О - 50 мг/л), 2 мМ фосфатный буфер натрия, 1 глюкозу и ацетосирингон в концентраций 100 М. Далее экспланты, в виде двухнедельных стерильных апикальных меристем и пазушных почек инокулируют в суспензии клеток агробактерий в течение 20-30 минут. После проведения этапа ко-культивации экспланты не отмывая переносят на твердую среду МС,содержащей ацетосирингон в концентраций 100 М и инкубируют в течение 2-3 суток при температуре 282 С. Второй день трансформации После ко-культивирования апикальные меристемы и пазушные почки высаживают на селективную питательную среду, содержащую фитогормоны кинетин и ИМК в концентрациях 0,01 мг/л, фосфинотрицин (РРТ - 3 мг/л) для отбора растений-трансформантов,и антибиотик цефотаксим(250 мг/л) для элиминации агробактерий и ацетосирингон в концентраций 100. Для хлопчатника присутствие ацетосирингона в средах, предназначенных, для инокуляции и ко-культивации является важным моментом. Поэтому для активации -генов. за 2 часа перед трансформацией в среду для инокуляции добавляют ацетосирингон в концентрации 100 М. Трансформированные апикальные меристемы и пазушные почки культивируют при оптимальных условиях для регенерации растений (при температуре 28-30 С и 16-часовом фотопериоде). Пассирование трансформированных апикальных меристем и пазушных почек проводят через каждые 10 дней. Пример 6. Мониторинг экспрессии генав системе транзиентной экспрессии Транзиентная экспрессия генанадежно детектируется методом, разработанным. - 1987. - . 6. - .3901 -3907.). Для мониторинга экспрессии гена,1/10 часть трансформированных эксплантов 2-3 дня после периода ко-культивации переносят в гистохимический реагент, состоящий из 0,5 М фосфатного буфера, 0.06 М феррицианида, 0.06 М ферроцианида, 0.1 тритон Х-100, 0,6 Ми 1.0 мМ 5-бром-4-хлор-3-индолил- глюкуроновой(-). Пробы инкубируют в гистохимическом реагенте 18-24 часа при температуре 37 С. После этого пробы отмывают в 70 этаноле и фиксируют в растворе(45 абсолютный этанол, 5 ледяная уксусная кислота,5 формальдегид). Приготовленные пробы анализируют на фазово-контрастном световом микроскопе. Экспрессию генаоценивают визуально по интенсивности окрашивания ткани или клеток в синий цвет (фиг.3). Пример 7. Селекция трансформированных клеток и тканей хлопчатника в культурес помощью фосфинотрицина (РРТ) В качестве селективного агента при пассировании каллусов и эксплантов используют фосфинотрицин, который является активным компонентом гербицида Баста, устойчивость к которому обеспечивается геном , который входит в состав конструкции 7. Для отбора трансформированных клеток, толерантных к фосфинотрицину, экспланты культивируют на селективных средах, содержащих 3, 5, 7 и 10 мг/л РРТ. Применяют несколько способов отбора трансформированных эксплантов. В первом случае используют среды с высокой концентрацией селективного агента (7 или 10 мг/л РРТ) и субкультивируют экспланты до тех пор, пока не останутся только стабильно устойчивые клетки. Теоретический такой вариант клеточной селекции обеспечивает гарантированный отсев всех чувствительных клеток. Однако длительная инкубация клеток в жестких селективных условиях негативно влияет на их способность к регенерации. Во втором случае используют среды с умеренной концентрацией селективного агента (3 мг/л РРТ). Такой мягкий способ клеточной селекции требует обязательного продолжения отбора на уровне растений. На среде с более низким содержанием РРТ выживают около 50 эксплантов. После двух месяцев селекции отбирают фосфинотрицин устойчивые растения регенеранты регенерированные из апикальных меристем и пазушных почек. Однако регенерированные из них растения могут оказаться чувствительными к гербициду Баста, как и контрольные растения. Исходя из полученных данных мониторинга экспрессии генав системе транзиентной экспрессии,которые показывают низкую компетентность сорта хлопчатника Туркистан к агробактериальной трансформации, проводится ступенчатая селекция. Такая селекция рекомендуется когда частота трансформированных клеток в культуре низка, то есть проводится отбор на средах с постепенно повышающейся концентрацией селективного агента. Таким образом,популяция клеток, обогащенная устойчивыми формами на первых этапах селекции, лучше переносит жесткие условия отбора на последующих этапах. Апикальные меристемы и пазушные почки сначала инкубируют на среде с 3 мг/л РРТ,выжившие экспланты пересаживают на среду с 5 мг/л РРТ, а выжившие на второй среде пересаживают, в свою очередь, на среду,5 содержащую 7 мг/л. РРТ. После трех циклов селекции остается только 10 регенерантов от начального количества эксплантов, но полученные из них растения оказываются значительно устойчивы к РРТ,чем контрольные нетрансформированные растения (фиг.4). Изучение селекции растений - регенерантов из трансформированных апикальных меристем и пазушных почек позволяет получить фосфинитрицин устойчивые регенеранты в результате ступенчатой селекции. Пример 8. Регенерация трансформированных растений из апикальных меристем и пазушных почек Побеги культивируют в течение месяца при температуре 28-30 С и 16-часовом фотопериоде. Отбор побегов, регенерировавших и выживших на среде с антибиотиком и селективным агентом РРТ проводят в течение двух месяцев после кокультивации. Регенераты, укоренившиеся на селективной среде высаживают в грунт, проростки Этапы выделения Экстракция ДНК Выделение/ осаждение ДНК СТАВ-метод Ткани хлопчатника гомогенизируют и инкубируют в СТАВ-буфере (2 М , 5 М ,0,5 М , 5 СТАВ) при 65 С в течение 1 ч. Осаждают смесью хлороформ-изопропанола (241) при комнатной температуре в течение 1 ч, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин, и отбирают верхнюю фазу. Осаждают ДНК изопропанолом из расчета 2/3 к объему супернатанта при комнатной температуре 10-12 часов, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 10 мин, удаляют супернатант. Высушивают осадок при комнатной температуре в течении 40 минут, затем ресуспендируют в деионизированной воде. Интеграцию гена РАТ в геном хлопчатника(фиг.8) демонстрируют ПЦР мониторинг на наличие данного гена, кодирующий фосфинотрицин ацетилтрансферазу, обеспечивающий устойчивость к гербициду глюфосинату аммония проверяют с 94 С 94 С 58 С 72 С 72 С 4 С помощью следующих праймеров прямой РАТ 5 - 3 и обратный РАТ 5-- 3. Синтез проводят в следующем температурном режиме Продукты ПЦР анализируют в 1 агарозном геле. Как видно из результатов разделения продуктов амплификации, представленных на электрофореграмме(фиг.5),наличие амплифицированных фрагментов длиной 443 пар нуклеотидов на дорожках 3-6 совпадающих по размеру с ПЦР-фрагментом плазмиды,свидетельствует об интеграции гена РАТ в ядерный геном растений хлопчатника. Проверяют геномную ДНК растенийтрансформантов на предмет агробактериального загрязнения, для исключения ложнопозитивных результатов, с использованием ПЦР и праймеров к консервативным участкам гена 2. Для этого анализа используют универсальные праймеры для без видимых корней пересаживают во влажный стерильный вермикулит в маджента боксы, затем пересаживают в смесь почвы и вермикулита 50/50,через 3-4 недели адаптированные проростки высаживают в грунт и выращивают в условиях теплицы. В результате изучения селекции трансформированных апикальных меристем и пазушных почек хлопчатника в культуреполучают укорененные,фосфинитрицин устойчивые растения - регенераты хлопчатника сорта Туркистан. Пример 9. Молекулярный анализ растенийтрансформантов Листья растений-трансформантов используют для выделения геномной ДНК и ПЦР анализа на наличие чужеродных генов. Качество выделенной геномной ДНК определяют при помощи электрофореза,концентрацию измеряют на спектрофотометре (нанодропе). Протокол выделения геномной ДНК из растенийтрансформантов хлопчатника сорта Туркистан праймер А 5-3 праймер С 5 - 3 праймер Е 5 - 3 Комбинация праймеров АС дают продукт 224 п.н., комбинация праймеров АЕ дают продукт 338 п.н. Наличие амплифицированных фрагментов длиной 224 и 338 пар нуклеотидов, соответственно указывает наличие 2 генов .(фиг.6). ПЦР мониторинг на наличие агробактериальных генов , проводят с помощью -ДНК полимеразы и выше указанных праймеров. Для начала анализируют штаммы(4404, ЕНА 105 и 0). Синтез проводят в следующем температурном режиме 94 С 94 С 50 С 72 С 72 С 4 С Продукты ПЦР анализируют в 1 агарозном геле. Далее, для исключения ложнопозитивных результатов анализируют полученные растениятрансформанты на наличие бактериальных 2 генов (фиг.7). Взрослые растения-трансформанты, высаженные в грунт проверяют на экспрессию гена ,обеспечивающий устойчивость к гербициду Баста. Для этого опрыскивают растения раствором фосфинотрицина в концентрации 5 мг/л (фиг.8). Таким образом, наличие фрагментов, размеры которых соответствуют ожидаемому фрагменту для генетической конструкций 7 с геноми отсутствие фрагментов,размеры которых соответствуют сгенам, а так же устойчивость к раствору фосфинотрицина подтверждают трансгенный статус созданных генетически модифицированных растений хлопчатника. Схема агробактериальной трансформации хлопчатника сорта Туркистан приведена на фиг.9. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения гербицидоустойчивых трансгенных растений хлопчатника сорта Туркистан, включающий стерилизацию семян,создание рекомбинантной плазмиды 7,содержащей гены, кодирующие фосфинотрицинацетилтрансферазу и- -глюкуронидазу,отличающийся тем, что семена хлопчатника,очищенные от линта, обрабатывают в растворе 70 этилового спирта, затем в 10 растворе гипохлорита натрия с добавлением 1-2 капель Твина-20,рекомбинантная плазмида,экспрессирующая гены фосфинотрицинацетилтрансферазы и- -глюкуронидазы под растительными промоторами, создается на базе двух существующих бинарных векторов 7 и , - опосредованная трансформация апикальных меристем и пазушных почек хлопчатника с бинарным растительным вектором 7 проводят с помощью штамма 4404., мониторинг трансформации проводят с помощью экспрессиигена, селекция трансформированных клеток и тканей хлопчатника в культурепроводят с помощью фосфинотрицина (РРТ), который является активным компонентом гербицида Баста.