Способ создания устойчивых к фитофторозу форм картофеля

(51) 01 4/00 (2006.01) 12 5/04 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Новизна изобретения - при использовании биотехнологических методов создание устойчивых форм картофеля к фитофторозу и идентификация,паспортизация их на основе молекулярногенетических -маркеров. Технический результат, может быть, достигнут при использовании клеточной селекции на устойчивость к фитофторозу, отбор каллусных толерантных линий,получение растенийрегенерантов картофеля, размножение клубней в теплице и полевых питомниках, оценка линий регенерантов картофеля на устойчивость к возбудителям фитофтороза и их идентификация на основе молекулярно-генетических -маркеров. Достижения технического результата позволит создать биотехнологическими методами паспортизированные устойчивые формы картофеля к фитофторозу для использования в селекционных программах и на основе их создать новый сорт картофеля. Аналог изобретения. Нами не найдено идентичного способа создания устойчивых форм картофеля к фитофторозу и идентификация их при использовании молекулярно-генетических маркеров.(72) Какимжанова Алмагуль Апсаламовна Хусанбаева Айслу Нурмагамбетовна Нечай Наталья Леонидовна Есимсеитова Асель Кайратовна Каримова Венера Конысбаевна Магзумова Гульмира Козовна Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ СОЗДАНИЯ УСТОЙЧИВЫХ К ФИТОФТОРОЗУ ФОРМ КАРТОФЕЛЯ(57) Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, а именно к получению форм картофеля, устойчивых к штаммам гриба. Изобретение может быть использовано в селекции и семеноводстве картофеля. Задача изобретения - создание устойчивых форм картофеля к фитофторозу и идентификация их на основе молекулярно-генетических -маркеров. Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, а именно к получению форм картофеля, устойчивых к штаммам гриба. Изобретение может быть использовано в селекции и семеноводстве картофеля. Причинами невысокой урожайности картофеля является вред, наносимый болезнями, вредителями и сорняками. Подсчитано,что картофель повреждается 38 видами грибов, среди которых наиболее распространенным является фитофтороз. Создание сортов картофеля, устойчивых к фитофторозу, является весьма актуальным. Развитие методов биотехнологии, в основе которых лежит выращивание изолированных органов, тканей и клеток на искусственных селективных питательных средах с последующей регенерацией целых растений,с новыми признаками, определяет все большее внедрение их в практику сельского хозяйства. Они способны значительно ускорить селекционный процесс. В настоящее время методами клеточной селекции можно создать ценные формы картофеля,устойчивые к болезням. Для селекции растений особое значение имеет использование молекулярных маркеров для различения и идентификации сортов культурных растений. Известен способ получения трансгенных форм картофеля сорта Скороплодный, устойчивых к температурным стрессам и к возбудителю фитофтороза, который может быть использован для создания новых форм сортов картофеля, способных давать стабильный урожай в разных почвенноклиматических зонах. Недостатком этого способа является то, что сорт картофеля Скороплодный является среднечувствительным к низким отрицательным,повышенным положительным температурам и фитофторозу. Кроме того, высокая устойчивость к возбудителю фитофтороза коррелирует с низкой клубневой продуктивностью. Очень трудно получить формы картофеля, сочетающие все три признака методом традиционной селекции. (Патент 2505955 А 01 Н 1/00. Способ получения форм картофеля сорта скороплодный, устойчивых к температурным стрессам и к возбудителю фитофтороза). Известен способ получения форм картофеля, устойчивых к возбудителям фитофтороза и альтернариоза, заключающийся в том, что листовые экспланты исходных сортов, вычлененные из тридцатидневных асептических растений исходных сортов, выращенных, помещают в чашки Петри с жидкой средой и прединкубируют в течение 1824 часов и температуре 22-24 С, затем вносят пипеткой 300 мкл на одну чашку ночной суспензионной культуры агробактерии, несущей плазмиду с геном антимикробного пептида-1 из звездчатки средней (мокрица) (.). (Патент 2524424 от 27.07.2014 А 01 Н 1/00 А 01 Н 4/00 А 01 Н 5/00. Способ получения форм картофеля, 2 устойчивых к возбудителям фитофтороза и альтернариоза). К недостаткам этих двух методов относится то,что при встраивании в растения чужеродного гена изменяется экспрессия собственных генов растения,что приводит к нарушению свойств растения, в том числе и тех, которые связаны с урожайностью. Кроме того, введенный ген очень часто утрачивает свои свойства, перестает экспрессироваться, что сводит на нет физические и экономические затраты,связанные с получением трансгенных растений. Наиболее близким аналогом, является способ,основанный на клеточной селекции, когда отбор устойчивых растений осуществляется на фоне селективного агента,дающего возможность отбирать растения, у которых изменен спектр фитостеринов, необходимых насекомым для прохождения полного цикла развития. В качестве селективного агента используют полиеновый антибиотик нистатин,который является неспецифическим селективным агентом, на его фоне можно отбирать любые изменения, связанные с проницаемостью клеточной мембраны, в том числе возможен отбор клеток, а затем растенийрегенерантов с измененным спектром фитостеринов, в силу чего такие растения не могут являться полноценным кормом для насекомых, что и приводит к снижению их численности. Недостатком этого способа является то, что применяемый селективный агент характеризуется широким спектром действия, что снижает, а иногда и сводит к нулю вероятность получения растений с направленно-измененным составом стеринов и нормальной морфологией. Кроме того,использование ультрафиолетового излучения, как мутагена, и отбор растений-регенерантов из устойчивых к селективному агенту клеточных культур на фоне нистатина, приводит к появлению очень большого числа аномальных растений,которые не пригодны для их использования в сельском хозяйстве (Патент 2141196 от 20.11.1999 А 01 Н 4/00, 12 5/04. Способ получения растений с комплексной устойчивостью к фитостеринозависимым вредителям). Аналог изобретения. Нами не найдено идентичного способа создания устойчивых форм картофеля к фитофторозу и идентификация их при использовании молекулярно-генетических маркеров. Задача изобретения - создание устойчивых форм картофеля к фитофторозу и идентификация их на основе молекулярно-генетических -маркеров. Новизна изобретения - при использовании биотехнологических методов создание устойчивых форм картофеля к фитофторозу и идентификация,паспортизация их на основе молекулярногенетических -маркеров. Технический результат может быть достигнут при использовании клеточной селекции на устойчивость к фитофторозу, отбор каллусных толерантных линий,получение растенийрегенерантов картофеля, размножение клубней в теплице и полевых питомниках, оценка линий регенерантов картофеля на устойчивость к возбудителям фитофтороза и их идентификация на основе молекулярно-генетических -маркеров. Достижения технического результата позволит создать биотехнологическими методами паспортизированные устойчивые формы картофеля к фитофторозу для использования в селекционных программах и на основе их создать новый сорт картофеля. В таблице 1 представлены результаты создания устойчивых форм картофеля к фитофторозу при использовании схем одноступенчатой и многоступенчатой клеточной селекции при различных концентрациях культурального фильтрата (КФ) гриба ., получению пробирочных растений-регенерантов,микроклональному размножению, размножению в теплице и полевых питомниках, оценке на устойчивость к штаммам гриба . . Поставленная цель достигается с помощью способа получения растений-регенерантов,включающего культивирование эксплантов на селективные среды для инициации каллуса, в процессе исследований за 2 года ввели 1714 эксплантов в культуруи индуцировали из них 74,4 каллусных тканей гибридов картофеля, оптимизировали схемы одноступенчатой и многоступенчатой клеточной селекции при использовании различных концентраций КФ гриба. для получения устойчивых каллусных линий картофеля. При одноступенчатой селекции наиболее оптимальными концентрациями КФ в питательной среде для получения растенийрегенерантов являлись 5, 10, 20 КФ гриба Наиболее оптимальными схемами для многоступенчатой селекции на устойчивость к фитофторозу для получения растений-регенерантов являлись МС 5 КФМС 10 КФ,МС 10 КФМС 20 КФ,МС 20 КФМС 30 КФ,МС 50 КФМС 20 КФ. Нам удалось получить при одноступенчатой и многоступенчатой селекции 387 пробирочных растений-регенерантов. Полученные растения-регенеранты картофеля, с селективных сред микроклонально размножили до 2561 пробирочных растений, из них 1462 высадили и размножили в теплице для получения миниклубней (фиг.1, 2). Провели сбор миниклубней растений-регенерантов картофеля в теплице и изучили структуру урожая (фиг.3). Таблица 1 Создание устойчивых форм картофеля к фитофторозу при использовании биотехнологических методов Генотип Собра нные мини клубни с теплицы,шт Микр очере нкова нные расте ния,шт 31 Полу ченные реген еранты,шт Собра Степень устойчивости к нные штаммам гриба . клубни с полевом питом нике, шт МС 5 КФМС 30-50 КФГибридМС 5 КФМС 30 КФГибридМС 5 КФГибрид МС МС 20 КФГибрид Относительно высокая устойчивость Высокая устойчивость Очень высокая устойчивость Средняя устойчивость Средняя устойчивость Средняя устойчивость Средняя устойчивость Высокая устойчивость Высокая устойчивость Высокая устойчивость Высокая устойчивость Высокая устойчивость Высокая устойчивость Очень высокая устойчивость Относительно высокая устойчивость Очень высокая устойчивость Очень высокая устойчивость Высокая устойчивость Высокая устойчивость Высокая устойчивость Очень высокая устойчивость Высокая устойчивость 3 Полу ченные реген еранты,шт 387 Микр очере нкова нные расте ния,шт 2561 Фиг.1 Высадка регенерантов картофеля в теплицу Фиг.3 Сбор урожая растений-регенерантов картофеля в теплице За 2 года урожай растений-регенерантов картофеля с теплицы составил 5925 клубней. В теплице по структуре урожая выделены линии растений-регенерантов картофеля первого поколения 9-10-04 МС 5 КФ, 6-10-03 МС 20 КФ, 6-10-03 МС 30 КФ, 18-10-03 МС 20 КФ,21-10-06 МС ., которые превысили исходные формы. Эти отобранные ценные линии регенерантов первого года переданы в Казахский научно-исследовательский центр картофелеводства и овощеводства (КазНИИКО) для вовлечения в селекционный процесс. Миниклубни, полученные в теплице в количестве 1900 штук высадили в полевой питомник. Сбор урожая линий регенерантов картофеля второго поколения проводили вручную, Собра нные мини клубни с теплицы,шт 5925 Собра Степень устойчивости к нные штаммам гриба . клубни с полевом питом нике, шт 8098 было собрано 8098 клубней. В полевом питомнике при проведении морфометрического анализа и по структуре урожая выделены линии регенерантов картофеля второго поколения 9-10-04 МС, 9-10-04 МС 5 КФ, 6-10-03 МС, 21-10-06 МС, 18-10-03 МС 20 КФ, 6-10-03 МС, 26-10-07 МС, 26-10-07 МС 5 КФ ., которые превысили исходные формы. Эти отобранные ценные линии регенерантов второго поколения переданы в Казахский научно-исследовательский центр картофелеводства и овощеводства (КазНИИКО) для размножения в конкурсном сортоиспытании и создании нового сорта, устойчивого к фитофторозу. Провели оценку растений-регенерантов картофеля первого и второго поколения на устойчивость к фитофторозу в лабораторных условиях. Выделили устойчивые растениярегенеранты картофеля к фитофторозу 9-10-04 МС 5 КФ, 6-10-03 МС, 6-10-03 МС 30 КФ,18-10-03 МС 20 КФ, 26-10-07 МС, 26-10-075 КФ, 21-10-06 МС, 21-10-06 МС 30 КФ,23-10-025 КФ, 21-10-0310 КФ. Достижения технического результата позволят получать в условияхустойчивые формы картофеля к фитофторозу, что значительно увеличить разнообразие сортов, гибридов и форм и повысить эффективность селекционных программ,направленных на создание нового сорта. В конечном этапе после оценки линий регенерантов картофеля первого и второго поколения на устойчивость к возбудителям фитофтороза провели молекулярно-генетическую идентификацию -маркерами и на основе их составили молекулярно-генетические паспорта. В таблице 2 представлены формулы молекулярно-генетических паспортов линий регенерантов картофеля первого поколения,которые составлены на основе 7 -праймеров ОРК 8, ОРК 9,8,14,15,3,12, (таблица 2). В таблице 3 представлены формулы молекулярно-генетических паспортов линий регенерантов картофеля второго поколения,которые составлены на основе 5 -праймеров ОРК 8, ОРК 9,14,15,3 (таблица 3). Таблица 2 ДНК - паспорт гибридов и регенерантов картофеля первого поколения Генотип 21-10-06 Г 4 В способе идентификация сортов и форм картофеля используют выделение ДНК из ростков глазков клубней и пробирочных растений картофеля, анализ геномной ДНК картофеля проводят с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Таблица 3 ДНК - паспорт гибридов и линий регенерантов картофеля второго поколения Генотип 21-10-06 Г Результат способа идентификации ценных форм картофеля на основе использования -маркеров достигается тем, что для каждой формы картофеля составляют молекулярно-генетический паспорт,который представлен в таблице 2 и 3, где показано,фрагментные участки специфичные для каждой линии. Таким образом, создание устойчивых форм картофеля к фитофторозу при использовании биотехнологических методов состоит из следующих этапов культивирование и отбор устойчивых каллусных тканей к КФ гриба . при использовании одноступенчатой и многоступенчатой клеточной селекции, получение пробирочных растений-регенерантов,микроклональное размножение, размножение в теплице и полевых питомниках, оценка на устойчивость к фитофторозу, идентификация и паспортизация молекулярно-генетическими маркерами. Достижения технического результата позволят получать в условияхустойчивые линии и формы картофеля к фитофторозу, что значительно увеличит разнообразие форм и повысит эффективность селекционных программ,направленных на создание нового сорта. На завершающем этапе для каждой линии регенерантов картофеля составляют молекулярногенетический паспорт при использовании праймеров и созданные устойчивые линии картофеля к фитофторозу передают в селекционные центры. Методика использования изобретения 1. Выделение и культивирование возбудителя фитофтороза Закладывали больные клубни картофеля во влажную камеру на 4-5 дней при температуре 1820 С для выявления возбудителя фитофтороза. Через 4-5 дней с ломтиков клубней образованный мицелий культивировали на питательные среды 1) овсяная среда 2) овяно - гороховая среда 3) агаровая среда. 2. Выделение чистой культуры возбудителя фитофтороза с помощью твердых сред Для получения изолированных колоний микроскопических грибов на твердую питательную среду наносили петлей мицелий гриба. После посева чашки Петри закрывали и ставили в термостат на 20-21 С в течение 7 дней. Через неделю на поверхности твердой среды вырастали колонии фитопатогенных грибов. 3. Изучение культурально-морфологических свойств возбудителей фитофтороза 6 Идентифицировали возбудителей фитофтороза с помощью микроскопического анализа. небольшое Препаровальной иглой отделяли количество налета мицелия или споровой массы,которые переносили в каплю воды и измельчали иглой. Использовали для идентификации микроскопс компьютерным изображением . 4. Выделение ДНК изолятов грибов Выделение ДНК осуществляли по методу описанном с соавторами. Концентрацию ДНК измеряли спектрофотометрическим методом с использованием спектрофотометрапри длине волны 260 нм. После количественной оценки была нормализована концентрация ДНК до 30 нг/мкл. 5. Амплификациярегионаизолятов грибов Реакция ПЦР была выполнена с универсальными праймерами 4-5-3, 5 53 в общем объеме 30 мкл. ПЦР смесь содержала 150 нг ДНК, 1 ед., 2,52, 10 п/моль каждого праймера. Программа ПЦР амплификации включала длительную денатурацию 95 С в течение 7 минут 35 циклов 95 С - 15 секунд, 52 С- 30, 72 С - 30 секунд заключительная элонгация 7 минут при 72 С, ПЦР программа была выполнена с применением амплификатора 9700 ( ). 6. Определение нуклеотидной последовательности Очистку ПЦР продуктов от не связавшихся праймеров проводили ферментативным методом используя,и щелочную фосфатазу (, ). Реакцию секвенирования проводили с применением 3.1) согласно инструкции производителя, с последующим разделением фрагментов на автоматическом генетическом анализаторе 3730 х 1(). 7. Определение фитотоксической активности изолятов гриба . Фитотоксическую активность изолятов гриба. определяли по методике (Лемеза Н. А.,2008) 8. Определение фитопатогенности изолятов гриба . Готовят суспензию конидий используя для этого чистую культуру изолятов гриба В каждый ломтик картофеля через надрез стерильной пипеткой вносят суспензию конидий гриба Затем помещают в термостат при температуре 20 С. Через 7 суток проводят учет поражения. В учетах отмечают размер поражения по наибольшему диаметру (мм) и интенсивность спороношения визуально (в баллах) 1-единичные конидиеносцы 2-конидиеносцы в массе просматриваются невооруженным глазом 3 интенсивное спороношение. 9. Получение культурального фильтрата (КФ) гриба . Для получения КФ гриба. культивировали изоляты на жидкую питательную среду Хелла, содержащую КН 2 РО 4 - 0,5 г/л, 4 0,25 г/л, 4 - 0,01 г/л, глюкозу - 25 г/л,аспарагин - 0,5 г/л, тиамин - 0,002 г/л, рибофлавин 0,002 г/л. Культивировали изоляты гриба. на жидкой среде Хелла в состоянии покоя при 18-20 С в течение 30 дней. Затем отфильтровали культуральную жидкость через фильтровальную бумагу и автоклавировали при 120 С в течении 30 минут. 10. Индукция первичной каллусной ткани картофеля Для получения каллусной культуры пассировали сегменты листьев и стеблей пробирочных растений картофеля на питательные среды. Каллус выращивали в темноте при 22-25 С и 60-70-ной относительной влажности воздуха. Пассирование каллуса на свежую питательную среду,осуществляли через каждые 30-40 дней. В качестве базовой среды для каллусообразования использовали среду Мурасиге и Скуга. 11. Схемы клеточной селекции на устойчивость к фитофторозу Для подбора оптимальных схем клеточной селекции на устойчивость генотипов картофеля к изолятам гриба. использовали одноступенчатую и многоступенчатую клеточную селекцию. При одноступенчатой селекции сегменты листьев и стеблей пробирочных растений картофеля культивировали на питательной среде МС и на селективной среде МС с следующими концентрациями КФ гриба . 5, 10,20, 30, 50. Также первичную каллусную ткань гибридов картофеля сразу помещали на питательную среду МС с 5, 10, 20, 30, 50 КФ, каллусы, сохранившие рост в стрессовых условиях, затем перенесли на питательную среду МС для регенерации. При многоступенчатой селекции каллусные линии гибридов картофеля, культивировали в течение 1-го пассажа на селективных средах - 5,10, 20, 30, 50, 2-ой и 3-ий пассаж культивировали на средах с 20 КФ, 30 КФ и 50 КФ гриба Выжившие каллусные линии в стрессовых условиях с КФ изолятов гриба. переносили на среду МС для получения растений-регенерантов. 12. Регенерация растений гибридов картофеля,полученных с селективных сред Для получения органогенных структур отобранные каллусные линии с селективных сред культивировали на питательных средах МС с добавлением экзогенных фитогормонов бензиламинопурина(2,4-Д),индолилуксусной кислоты (ИУК), зеатина, кинетина в следующих концентрациях 0,5 1,0 2,0 3,0 мг/л. Образовавшиеся органогенные структуры генотипов картофеля пересаживали в пробирки на питательные среды МС для получения растений-регенерантов. Культивирование пробирочных растенийрегенерантов проводили в фактеростатной комнате,где поддерживали относительную влажность воздуха 70, температуру 24 С-25 С, 16-часовое освещение люминесцентными лампами с интенсивностью 5000-7000 лк. 13. Размножение линий регенерантов путем микрочеренкования Для быстрого размножения пробирочных растений-регенерантов картофеля проводили микроклональное черенкование. Черенкование растений-регенерантов проводили с интервалом 2428 дней. Для микроклонального размножения растений-регенерантов картофеля использовали среду МС с различными вариациями добавления фитогормонов,антиоксидантов,витаминов,аминокислот. 14. Оценка пробирочных линий регенерантов картофеля на устойчивость к фитофторозу в лабораторных условиях Пробирочные растения в фазе 6-7 настоящих листьев, растущие в стеклянных пробирках,опрыскивают суспензией зооспор в концентрации 10-12 или 20-25 конидий гриба в поле зрения микроскопа. Первый учет поражения сеянцев проводят примерно на 7-й и на 14-й день в зависимости от развития болезни. Устойчивость образца определяют по 9-балльной шкале. 15. Высадка и размножение регенерантов в теплицу и полевой питомник Укоренившиеся пробирочные растениярегенеранты картофеля высаживали в пленочную теплицу на глубину 4-6 см при схеме посадки 3515 см. В теплице за высаженными растениямирегенерантами проводили уход в течение всей вегетации. В полевом питомнике использовали схему посадки миниклубней растений-регенерантов картофеля 7030 см. Для этого предварительно подготовили почву для высадки миниклубней первого года. В течение вегетации в полевом питомнике проводили уход и полив за высаженными миниклубнями картофеля. Рыхление и окучивание посадок миниклубней проводили 2 раза. 16. Сбор урожая клубней регенерантов картофеля и изучение структуры урожая в пленочной теплице и в полевом питомнике Учет и структуру урожая клубней растенийрегенерантов картофеля проводили путем взвешивания товарной фракции каждого генотипа с одного куста, подсчитывали количество клубней с одного куста. Клубни картофеля описывали по 7 внешним признакам, сортировали по фракциям мелкие - от 0,8 до 4,5 см средние - от 4,6 до 7,0 см крупные - от 7,1 до 12 см. Провели хозяйственнобиологическую характеристику клубней гибридов и растений-регенерантов картофеля первого поколения. 17. Тестирование растений-регенерантов картофеля на вирусную инфекцию Отбирали листья растений-регенерантов картофеля, растущих в пленочной теплице для определения на наличие вирусной инфекции ,методом ИФА. Для тестирования меристемных линий картофеля на вирусы использовали специально выпускаемые тестсистемы для диагностики вирусов Всероссийского НИИ картофельного и овощного хозяйства(п. Коренево). 18. Оценка клубней регенерантов картофеля на устойчивость к фитофторозу Для оценки устойчивости к фитофторозу от каждого испытуемого генотипа брали по 2 клубня без механических повреждений и визуальных признаков заболеваний. Перед заражением клубни мыли, вырезали лунку размером 77 мм, затем вносили мицелий гриба .закрывали отверстие и затем помещали во влажную камеру(кюветы с увлажненной фильтровальной бумагой). В течение опыта влажность поддерживали на уровне 80-90, температуру - 18-20 С. Учет осуществляли через 14 дней от момента заражения, где учитывали глубину проникновения гриба (некроза) путем разрезания клубня в продольном направлении. Средний балл устойчивости определяли по 9-балльной шкале. 19. Выделение ДНК картофеля стандартными протоколами для идентификации молекулярногенетическими -маркерами Для выделения ДНК использовали ростки глазков клубней картофеля, полученные путем проращивания в течение 14 суток в фактеростатной комнате. Выделение ДНК проводили по методике К.(1991). Затем проводили определение количества и качества выделенной ДНК. 20. Амплификация ДНК при использовании- праймеров Для -анализа полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводят в объеме реакционной смеси 15 мкл содержащем 10 хбуфер - 1,5 мкл,смесь 4(2 ) - 1,5 мкл, 2 (25 ) 1,5 мкл,- маркер (10 рМ) - 2,0 мкл,ДНК полимераза (5 ед/мкл) - 0,2 мкл, ДНК (100 нг/мкл) 1,0 мкл. Использовали следующий режим ПЦР для произвольно амплифицированного полиморфизма ДНК (-анализ) предварительная денатурация при 94 С в течении 5 мин следующие 35 цикла 30 с - денатурация при 94 С 45 с - отжиг праймера при 37 С 1 мин синтез при 72 С конечная элонгация при 72 С в течении 7 мин. Электрофорез продуктов амплификации со случайными праймерами проводили в агарозном геле (1,7 агароза, ТВЕ-буфер, с добавлением 5 мкл бромистого этидия) с использованием камеры для 8 горизонтального электрофореза. Каждый амплифицированный фрагмент ДНК на агарозном геле рассматривался как индивидуальный дескриптор с определенной молекулярной массой,которую определяли,используя маркер молекулярной массы 100 р 1,5. После электрофореза гели анализировали в УФ-свете и фотографировали с использованием компьютерной программы. При использовании -маркеров полученные данные заносили в таблицу, в которой для каждого генотипа и для всех праймеров было указано присутствие (1) или отсутствие (0) каждого дескриптора. На основе этих данных была построена матрица для расчета генетических расстояний по Нею(,1987) между сравниваемыми формами. Для построения дендрограмм использовали алгоритми компьютерную программу . В качестве объектов использовали 21 гибридов картофеля казахстанской селекции, которые были любезно предоставлены селекционерами КазНИИКО 2-10-09, 6-10-03, 9-10-03, 2-10-12, 2210-11, 26-10-07, 9-10-04, 15-09-2, 23-10-03, 21-10-06,4-10-01, 23-10-10, 18-10-03, 21-10-06, 21-10-03, 1810-02, 26-09-03, 23-10-01, 29-10-03, 23-10-02, 23-1012. В качестве фитопатогенного материала использовали выделенные нами изоляты гриба. с больных клубней картофеля Северного и Центрального Казахстана. Примеры выполнения предлагаемого способа. Пример 1. Способ создания ценных линий картофеля с помощью одноступенчатой селекции с применением КФ гриба . При одноступенчатой селекции сегменты листьев и стеблей пробирочных растений картофеля культивировали на питательной среде МС и на селективной среде МС с следующими концентрациями КФ гриба . 5, 10,20, 30, 50. Также первичную каллусную ткань гибридов картофеля сразу помещали на питательную среду МС с 5, 10, 20, 30, 50 КФ, каллусы, сохранившие рост в стрессовых условиях, затем перенесли на питательную среду МС для регенерации. Процент регенерации варьировал от 9,1 до 58,3 в зависимости от селективной среды. На селективных средах высокий процент регенерации наблюдали у гибридов 26-10-07 - 37,5(МС 5 КФ). Наименьшую регенерационную способность показали генотипы 21-10-03 - 9,1 (МС 50 КФ), 23-10-01 - 10(таблица 4). Практически на всех анализируемых гибридах выход регенерантов с увеличением концентрации селективного фактора снижался. Например, на гибриде 9-10-04 с увеличением концентрации КФ в питательной среде процент регенерации снижался - МС 5 КФ - 32,0,МС 10 КФ - 29,4 МС 20 КФ - 20 МС 50 КФ - 20. Таким образом, резкое повышение концентрации селективного агента 30 КФ, 50 КФ в питательной среде подавляет рост каллусных тканей, снижает регенерационную способность и выход растений-регенерантов. При одноступенчатой селекции наиболее оптимальными концентрациями КФ в питательной среде для получения растенийрегенерантов являлись 5, 10, 20 КФ. Таблица 4 Результаты одноступенчатой клеточной селекции на устойчивость к КФ гриба . Генотип МС МС 5 КФ МС 10 КФ МС 20 КФ МС 30 КФ МС 50 КФ МС МС 5 КФ МС МС 5 КФ МС 10 КФ МС 20 КФ МС 5 КФ МС 10 КФ МС 20 КФ МС МС 5 КФ МС 10 КФ МС 20 КФ МС 50 КФ МС 5 КФ МС 10 КФ МС 20 КФ МС 30 КФ МС 50 КФ МС 5 КФ МС 10 КФ МС 20 КФ Пример 2. Способ создания ценных линий картофеля с помощью многоступенчатой селекции с применением культурального фильтрата гриба. При многоступенчатой селекции каллусные линии гибридов картофеля, культивировали в течение 1-го пассажа на селективных средах - 5,10, 20, 30, 50, 2-ой и 3-ий пассаж культивировали на средах с 20 КФ, 30 КФ и 50 КФ гриба Выжившие каллусные линии в стрессовых условиях с КФ изолятов гриба. переносили на среду МС для получения растений-регенерантов (фиг.4). Высокий процент устойчивых каллусных линий наблюдали на схеме культивирования МС 5 КФМС 10 КФ у генотипов 21-10-06,9-10-04, 23-10-02 (таблица 5). Низкий процент устойчивых каллусных линий было показано на Пассирован ные каллусы на регенерацию,шт 109 25 17 5 5 5 55 47 26 24 12 6 22 27 9 60 10 5 2 7 12 4 3 11 11 17 10 10 556 схеме культивирования МС 20 КФМС 30 КФ у генотипов 9-10-04 - 14,2 и 6-10-03 - 14,3 на схеме МС 30 КФМС 50 КФ. Общее количество растений-регенерантов составило 18 пробирочных растений при использовании многоступенчатой селекции. 1-каллусные линий на среде МС с 10 КФ 2-формирование каллусных линий по типу органогенеза 3- регенерация растений Фиг.4 Пассирование каллусных линий на селективных средах и регенерация растений картофеля 9 Таблица 5 Подбор схем многоступенчатой клеточной селекции на устойчивость к КФ гриба . Генотип Следовательно, результаты показали, что длительное воздействие стрессового фактора приводило к тому, что каллусные ткани теряли морфогенетические способности, прекращался их рост и происходил некроз клеток. Наиболее оптимальными схемами клеточной селекции на устойчивость к фитофторозу для получения растений-регенерантов являлись МС 5 КФ 10 КФ,МС 10 КФМС 20 КФ,МС 20 КФМС 30 КФ,МС 50 КФМС 20 КФ. При использовании многоступенчатой селекции мы смогли получить растения-регенеранты на повышенных концентрациях КФ - 30, 50. Таким образом, созданные ценные формы картофеля, которые оценены на устойчивость к фитофторозу и паспортизированы при использовании молекулярно-генетических маркеров представлены в таблице 1. Аналогичные ценные формы картофеля,устойчивые к фитофторозу можно получить при использовании других генотипов. Также можно составить паспорта для любых форм растений выборки растений картофеля неизвестного происхождения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ создания устойчивых к фитофторозу форм картофеля, включающий выделение и идентификацию штаммов гриба,получение и микроклональное размножение растений-регенерантов картофеля,размножение для получения клубней, последующую оценку полученных форм на устойчивость к фитофторозу и их идентификацию молекулярногенетическими -маркерами, отличающийся тем, что для отбора устойчивых каллусных линий к культуральному фильтрату грибаиспользуют схемы одноступенчатой и многоступенчатой клеточной селекции