Трансдермальный липосомальный лекарственный препарат для лечения туберкулеза

(51) 61 9/127 (2006.01) 61 31/4965 (2006.01) 61 44/09 (2006.01) 61 31/133 (2006.01) 61 31/06 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ назначения, и может быть использовано в качестве средства для лечения туберкулеза. Трансдермальный липосомальный лекарственный препарат для лечения туберкулеза,содержит активные вещества противотуберкулезные химиотерапевтические средства первого ряда и вспомогательные вещества- липосомы фосфатидилинозитола размером менее 1 мкм, изготовленные из полярного, заряженного фосфолипида,оболочка которых укреплена глютаматдегидрогеназой и скваленом,при следующем соотношении компонентов мг/мл изониазид - 0,005-0,02 мг/мл, пиразинамид - 0,0050,02 мг/мл, этамбутол - 0,005-0,02 мг/мл,фосфатидилинозитол 1 мг/мл,глютаматдегидрогеназа - 2 - 4 мг/мл, сквален 1 мг/мл. Предлагаемое средство расширяет арсенал лекарственных средств, применяемых в медицине в качестве противотуберкулезных при лечении КСТ, в том числе и некоторых внелегочных форм,повышает эффективность лечения,снижает побочные эффекты терапии.(72) Гильманов Мурат Курмашевич Бегзат Аскар Нагиулы Туткышбаев Серик Оспанович Абилдаев Тлеухан Шилдебаевич Аманжолова Лайля Кусайыновна Карабалин Арман Балтабаевич Егизбаева Шынар Амангельдиевна Гильманова Сауле Муратовна Кейкибаев Алтынбек Ниеталиевич(73) Республиканское государственное казенное предприятие Национальный центр проблем туберкулеза Республики Казахстан Министерства здравоохранения Республики Казахстан(54) ТРАНСДЕРМАЛЬНЫЙ ЛИПОСОМАЛЬНЫЙ ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗА(57) Изобретение относится к медицине, а именно к фармацевтической промышленности, производящей препараты лечебного и профилактического Изобретение относится к медицине, а именно к фармацевтической промышленности, производящей препараты лечебного и профилактического назначения, и может быть использовано в качестве средства для лечения туберкулеза. Значительной проблемой современной фтизиатрии являются многочисленные побочные действия противотуберкулезных препаратов (ПТП),что нередко приводит к ограничению их применения, а иногда и к отмене. При пероральном введении, ПТП с задержкой достигают очага поражения, частично инактивируются в желудочнокишечном тракте, оказывают гепатотоксическое и нейротоксическое действие, могут вызывать желудочно-кишечные расстройства (антибиотикоассоциированную диарею). Все эти проблемы в равной степени характерны и для костно-суставного туберкулеза (КСТ) - формы, наиболее часто приводящей к потере двигательной активности и инвалидизации пациента. В связи с чем,разработка новой,трансдермальной липосомальной формы противотуберкулезного препарата на основе липосом позволит повысить эффективность комплексной терапии КСТ и избежать побочных эффектов ПТП. Известен противотуберкулезный лекарственный препарат первого ряда изониазид, обладающий бактерицидным действием в отношении микобактерий туберкулеза (МБТ).(Справочник Видаль. Лекарственные препараты в Казахстане.- АстраФармСервис.-2010 г,- раздел 3, с.788). Недостатком данного препарата является ряд побочных явлений со стороны нервной системы головная боль, головокружение, реже парестезии,онемение конечностей, периферическая невропатия,неврит зрительного нерва, полиневрит, психозы,изменение настроения, депрессия. Со стороны ССС сердцебиение, стенокардия, повышение АД. Со стороны пищеварительной системы тошнота, рвота,гастралгия, токсический гепатит. Возможны при приеме внутрь аллергические реакции кожная сыпь,зуд, гипертермия, артралгия. Местные реакции раздражение в месте инъекции. Известен противотуберкулезный лекарственный препарат первого ряда этамбутол, обладающий бактериостатическим действием в отношении микобактерий туберкулеза (МБТ).(Справочник Видаль. Лекарственные препараты в Казахстане.- АстраФармСервис.-2010 г,- раздел 3, с.743). Недостатком данного препарата является ряд побочных явлений со стороны нервной системы и органов чувств слабость,головная боль,головокружение,нарушение сознания,периферические невриты,со стороны пищеварительной системы снижение аппетита,тошнота, рвота, гастралгия, нарушение функции печени - повышение активности печеночных трансаминаз. Аллергические реакции дерматит,кожная сыпь,зуд,артралгия,лихорадка, 2 анафилаксия, со стороны выделительной системы гиперурикемия, обострение подагры. Известен противотуберкулезный лекарственный препарат первого ряда пиразинамид, обладающий бактериостатическим действием в отношении микобактерий туберкулеза (МБТ).(Справочник Видаль. Лекарственные препараты в Казахстане.- АстраФармСервис.-2010 г,- раздел 3, с.873). Препарат также обладает рядом побочных явлений на него часто возникают аллергические реакции и лихорадочные реакции (резкое увеличение температуры тела),нередко диспепсические явления(расстройства пищеварения), ухудшение аппетита, головная боль,изредка - высокая возбудимость. При длительном применении оказывает токсическое действие на печень. Задачей изобретения является разработка нового трансдермального липосомального лекарственного препарата для лечения туберкулеза. Технический результат - расширение арсенала лекарственных средств, применяемых в медицине в качестве противотуберкулезных при лечении КСТ, а так же некоторых других внелегочных форм,повышение эффективности лечения, снижение побочных эффектов терапии. Полученный липосомальный препарат из природных неиммуногенных веществ, отличается от всех известных липосомальных препаратов высокой стабильностью и прочностью,отсутствием склонности к агрегации. Полученный лекарственный препарат обладает свойством легко проникать через ткани кожи, мышцы к костям в область их поражения туберкулезом. Лекарственный препарат обладает длительным сроком хранения - более 2-х лет в стерильных условиях. Указанный технический результат достигается тем, что предлагаемый лекарственный препарат для лечения туберкулеза, также как и аналоги,содержащий активные вещества противотуберкулезные химиотерапевтические средства первого ряда, согласно изобретению отличается тем,что выполнено для трансдермального применения в виде мази и содержит вспомогательные вещества - липосомы фосфатидилинозитола размером менее 1 мкм,изготовленные из полярного,заряженного фосфолипида,оболочка которых укреплена глютаматдегидрогеназой и скваленом, загруженные противотуберкулезными химиотерапевтическими средствами первого ряда при следующем соотношении компонентов мг/мл Активные вещества изониазид 0,005-0,02 мг/мл пиразинамид 0,005-0,02 мг/мл этамбутол.0,005-0,02 мг/мл Вспомогательные вещества фосфатидилинозитол.1 мг/мл глютаматдегидрогеназа.2-4 мг/мл сквален 1 мг/мл Основу микрокапсул составляет фосфатидилинозитол (ФИ), представляющий собой шестиатомный спирт - инозитол, соединенный с 3-м атомом глицерола, к 1 и 2 углеродному атому которого присоединены две жирные кислоты с четным числом углеродных атомов от С 12 до С 22. Так как ФИ имеет отрицательный заряд,получаемые микрокапсулы заряжены отрицательно. Вследствие наличия отрицательного заряда они отталкиваются друг от друга и поэтому не способны к агрегации. Для придания гидрофильности,прочности и стабильности микрокапсул в ФИ мембраны встраивают молекулы глютаматдегидрогеназы. Кроме того для придания капсулам прочности добавляют сквален углеводород тритерпенового ряда. Принадлежит к группе каротиноидов. Сквален - это природный ненасыщенный углеводород, которому не хватает 12-ти атомов водорода до стабильного состояния,при соединении с карбоксильной группой осуществляет захват водорода, между несколькими молекулами фосфолипида, скрепляя ламелярные слои липосом между собой, таким образом, играет стабилизирующую и скрепляющую роль в структуре капсул. Сквален легко проникает через кожу внутрь организма, воздействует на весь организм и является мощным иммуностимулятором. Раствор микрокапсул может храниться в стерильных условиях более 3-х лет. Препарат получают следующим образом Для получения микрокапсул проводят суспендирование фосфатидилинозитола в буферном растворе с последующим ультразвуковым диспергированием. Конечная концентрация фосфатидилинозитола в растворе 1 мг/мл. Затем микрокапсулы инкубируют с гомогенной глютаматдегидрогеназой, взятой в концентрации от 1 мг/мл до 4 мг/мл, с оптимумом 2 мг/мл, не менее 12 часов. Несвязавшиеся молекулы глютаматдегидрогеназы удаляют гельхроматографией на колонке с сорбентом Сефароза 2 В или Сефароза - 4 В. Расчеты показали, что с фосфатидилинозитольными липосомами связывается 0,2 глютаматдегидрогеназы от всего объема полученных микрокапсул. Микрокапсулу загружают с помощью ультразвукового диспергирования со скваленом и противотуберкулезными препаратами первого ряда изониазидом, пиразинамидом, этамбутолом. Пример 1 При концентрации ФИ в растворе 0,5 мг/мл концентрация липосом недостаточна для получения микрокапсулярного лекарственного средства. Пример 2 При концентрации ФИ в растворе 2 мг/мл наблюдался перерасход дорогостоящего ФИ. Эта концентрация ФИ не увеличивала эффективности микрокапсулярного лекарственного средства. Пример 3 Концентрация глютаматдегидрогеназы 1 мг/мл оказалась недостаточна для полного покрытия ФИ липосом. Пример 4 При концентрации глютаматдегидрогеназы 5 мг/мл не увеличивала эффективности микрокапсулярного лекарственного средства, а лишь приводила к ненужной трате дорогостоящего препарата. Пример 5 Способ получения микрокапсул раствор фосфатидилинозитола, взятого в концентрации 1 мг/мл суспендируют в буферном растворе,подвергают ультразвуковому диспергированию при средней силе тока в течение нескольких минут и получают микрокапсулы размером менее 1 мкм. Микрокапсулы инкубируют с гомогенной глютаматдегидрогеназой, взятой в концентрации 2-4 мг/мл, не менее 12 часов. Несвязавшиеся молекулы глютаматдегидрогеназы удаляют гель хроматографией на колонке с сорбентом Сефароза 2 В или Сефароза - 4 В. Пример 6 - Загрузка ФИ микрокапсул скваленом и противотуберкулезными препаратами первого ряда Для получения нанокапсулярной формы лекарственного препарата нанокапсулы перемешивали со скваленом и с противотуберкулезными препаратами первого ряда изониазидом, пиразинамидом, этамбутолом с конечной концентрацией в микрокапсулах сквален - 1 мг/мл Изониазид - 0,005-0,02 мг/мл Пиразинамид - 0,005-0,02 мг/мл Этамбутол - 0,005-0,02 мг/мл путем ультразвукового диспергирования. В Национальном центре проблем туберкулеза МЗ РК проводилось изучение действия предлагаемого препарата на животных. Изучение острой токсичности препарата на животных В результате исследования, было выявлено, что препарат в диапазоне доз 20 мг/кг и 30 мг/кг не вызывал каких-либо достоверных изменений в состоянии животных, а также не приводил к гибели животных в течение 5 суток эксперимента. При этом данная доза в 30 раз превышает терапевтическую дозу. Следовательно, данная доза препарата является нетоксичной при его однократном внутрибрюшинном введении. Изучение хронической токсичности препарата на животных В результате исследования было выявлено, что введение животным препарата в дозе 30 мг/кг 50 мг/кг приводило к появлению потливости,диспепсическим явлениям. В этой группе также было выявлено и снижение суточного потребления корма и воды. Анализ весовых коэффициентов массы тела показал снижение массы тела. В то же время видимых изменений со стороны внутренних органов выявлено не было. Что касается доз препарата 10-20 мг/кг, то по исследуемым показателям не удалось выявить каких-либо изменений при применении на протяжении 2 месяцев. Необходимо отметить,что в течение последующих 30 дней после окончания эксперимента никаких патогенных изменений в состоянии животных, а также их гибели не наблюдалось. Это свидетельствует о том, что действие препарата при его многократном введении не имеет отдаленных токсических последствий. Таким образом, многократное трансдермальное применение препарата не сопровождалось гибелью животных, уменьшением их массы, изменением поведения и общего состояния животных. Анализ местно-раздражающего действия трансдермального липосомального лекарственного препарата. Анализ местно-раздражающего действия на кожу хвоста 6 крыс показал, что препарат, загруженный ПТП 1-ого ряда, во всех исследованных концентрациях не вызывал изменений кожного покрова в сравнении с контрольной группой. Кроме того, не наблюдалось также и каких-либо достоверных изменений со стороны кожного покрова и в восстановительный период. Анализ местно-раздражающего действия на кожу спины 6 кроликов также показал отсутствие изменений кожного покрова при аппликациях препарата, загруженного ПТП 1-ого ряда, во всех исследованных концентрациях в сравнении с контрольной группой. Кроме того, у животных не наблюдалось каких-либо достоверных изменений со стороны кожного покрова и в восстановительный период (таблица 1). Таблица 1 Оценка действия препарата, загруженного ПТП 1-ого ряда, на кожный покров хвоста животного при многократных экспозициях Концентрация препарата (мг/мл) Контр. 20,0 15,0 10,0 5,0 2,5 1,0 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 Примечание О - нет эффекта 1 - отек и эритема 2 - отек, инфильтрация 3 - некроз Таблица 2 Оценка действия препарата, загруженного ПТП 1-ого ряда, на кожный покров спины животного при многократных экспозициях Концентрация препарата (мг/мл) Контр. 20,0 15,0 10,0 5,0 2,5 1,0 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 Примечание О - нет эффекта 1 - отек и эритема 2 - отек, инфильтрация 3 - некроз Таким образом, в исследованных концентрациях препарат, загруженный ПТП 1-ого ряда, не проявлял какого-либо раздражающего действия на слизистую оболочку в сравнении с контролем. В восстановительный период также не было отмечено никаких изменений кожных покровов. Таблица 3 Оценка действия препарата, загруженного ПТП 1-ого ряда, на слизистую оболочку глаз животного при многократных экспозициях Концентрация препарата (мг/мл) Контр. 20,0 15,0 10,0 5,0 2,5 1,0 0,5 1 1 0 0 0 0 0 0 Примечание 0 - нет эффекта 1 - поверхностный конъюнктивит 2 - глубокий конъюнктивит 3 - кератит 4 - ожог слизистой При использовании препарата, загруженного ПТП 1-ого ряда, в концентрации 20 мг/мл у 6 кроликов выявлено развитие поверхностного,незначительного конъюнктивита, проявляющегося покраснением конъюнктивы и обильным слезотечением. При концентрации 15-10 мг/мл и менее препарат не проявлял какого-либо раздражающего действия на слизистую оболочку в сравнении с контролем. Необходимо отметить, что все выявленные изменения в слизистой были транзиторными, так как через 1 сутки после эксперимента они регрессировали. Помимо этого, в восстановительный период также не было отмечено никаких изменений в слизистой глаз. Исследование влияния препарата на слизистую ротовой полости не выявило достоверных изменений в сравнении с контрольной группой. Более того, никаких других признаков местнораздражающего действия препарата в восстановительный период обнаружено не было. Таким образом, анализ местно-раздражающего действия в различных тест-системах показал, что препарат можно отнести к средствам с очень слабым раздражающим эффектом. При этом в большинстве тест-систем он не проявлял раздражающего действия даже в исходной концентрации. Исключением, является слизистая глаз, на которую препарат оказывает достоверный раздражающий эффект при повышении его концентрации более 20 мг/мл. Однако эти изменения по своему характеру были транзиторными,так как элиминировались после отмены воздействия. Кроме того, препарат не вызывает никаких отдаленных изменений, поскольку ни в одной тест-системе не удалось выявить каких либо отклонений от контрольной группы в течение 3 недель после отмены препарата. Изучение фармакокинетики препарата в эксперименте на животных Для исследования фармакокинетики в биологической жидкости (лимфа) были выбраны 6 здоровых кроликов мужского пола в возрасте от 6 до 8 месяцев. Критерии включения в исследованиевозраст 6 - 8 месяцевнаблюдения в течение недели не выявили наличия каких-либо заболеваниймужские особи, средняя нормальная температура тела животного составляла 38,5 - 39,5 град. С без признаков каких-либо заболеваний, и в течение недели не превышала 40 С. Критерии исключения из исследованияПревышение температуры тела в течение наблюдения выше 40 СЖенские особи Молодые особи менее 6 месяцевОсоби, возраст которых превышает 9 месяцевБольные или перенесшие инфекционные заболевания особи. За день до исследования объектам исследования выбривали участок кожи, размером в 10 кв.см,выбранный для подкожного вживления катетера, с помощью которого собирали лимфу. Вечером того же дня контролировали герметичность мешка и наличие лимфы в катетере. Приблизительно в 9 часов утра подготовленному для испытания животному наносили на выбритую поверхность около 1 г. мази. Затем в течение последующего часа животное удерживалось в определенном положении с целью полного впитывания мази в наружный кожный слой животного. Для отбора лимфы из подкожного слоя использовали одноразовые инсулиновые шприцы (024 час). Первые 2 часа после нанесения мази на поверхность кожи животного, непосредственно наблюдая за животным, отбирали лимфу. Образцы лимфы отбирались в количестве 1 мл. Лимфу переносили из шприцов в эппендорфные пробирки в дискретные интервалы времени в соответствии с таблицей 4 и замораживали при температуре -8 С. Таблица 4 График отбора проб кровипробы Время после приема препарата (час) Стабильность концентрации ПТП в лимфе при(-8 С) в течение 1 недели подтверждалась экспериментально, повторной подготовкой образцов и измерением концентрации ПТП. Снижение концентрации ПТП при хранении не превышало 0,1 от первоначально измеренных величин. Концентрацию ПТП в лимфе животных определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектированием. В работе использовали в качестве стандартов ВЭЖХ - субстанции ПТП первого ряда,предоставленные бактериологической лабораторией НЦПТ РК. Хроматографирование проводили в градиентном режиме. Расчет результатов проводили при помощи программыметодом внешнего стандарта. Калибровочную кривую получали в результате анализа проб стандарта определяемого соединения на каждый ПТП (для изониазида, этамбутола,рифампицина). В таблице 5 приведены средние показатели концентрации ПТП в лимфе животного при однократном применении препарата. Таблица 5 Данные полученные при однократном применении препарата в лимфе животногопобы 1 2 3 4 5 6 7 8 Таким образом фармакокинетический анализ предлагаемого препарата в лимфе животного при однократном применении С мах этамбутола 5 составила 6,84 мкг/мл, а рифампицина 13,57 мкг/мл, в тоже время концентрация изониазида была ниже предела обнаружения, и только в 3 пробе, через один час после нанесения мази концентрация изониазида составила 3,7 мкг/л. Изучение стабильности исследуемого препарата Стабильность (устойчивость) лекарственного средства тесно взаимосвязана с его качеством. Исследование стабильности препарата в зависимости от различных факторов, установление сроков его годности - одна из важнейших задач доклинических испытаний. Согласно Международной конференции по гармонизации технических требований для регистрации фармацевтических препаратовиспытания стабильности лекарственного препарата осуществляли в соответствии с руководством по определению стабильности новых лекарственных форм 1. Согласно руководствудля тестирования новых лекарственных форм с измененной системой транспортной доставки лекарственных форм, а липосомные системы, несомненно, подпадают именно под эту категорию, испытания на стабильность были проведены в течение 6 месяцев. Учитывая,региональные особенности для испытания препарата была выбрана температура 40 С. С целью определения начальных концентраций активных компонентов три партии испытуемого лекарственного средства (мазь), полученного из НИИ проблем биологии и биотехнологии подверглись количественному и качественному испытанию, согласно разработанному методу определения , , , ЕМВ в мазевых лекарственных формах (таблица 6). Таблица 6 Начальные концентрации активных ингредиентов Партии 1 2 3 Пробы помещались в суховоздушный термостат с температурой 37,7 град.С, и отбирались с периодичностью раз в месяц. Таблица 7 Условия хранения препарата Исследование Ускоренное Полученные данные после хроматографического определения рассчитывались по следующей формулеактивного ингредиент а Где, С (нач) - начальные концентрации активного ингредиента в лекарственной форме С(период) концентрация активного ингредиента за исследуемый промежуток времени Таким образом, в результате испытания на стабильность трансдермального липосомального препарата, загруженного ПТП 1-го ряда, был определен срок хранения 18 месяцев . ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Лекарственный препарат для лечения туберкулеза, содержащий активные вещества противотуберкулезные химиотерапевтические средства первого ряда, отличающийся тем, что Минимальный испытательный период 6 месяцев выполнен для трансдермального применения в виде мази и содержит вспомогательные вещества липосомы фосфатидилинозитола размером менее 1 мкм, изготовленные из полярного, заряженного фосфолипида,оболочка которых укреплена глютаматдегидрогеназой и скваленом, загруженные противотуберкулезными химиотерапевтическими средствами первого ряда при следующем соотношении компонентов мг/мл Активные вещества изониазид 0,005-0,02 мг/мл пиразинамид 0,005-0,02 мг/мл этамбутол 0,005-0,02 мг/мл Вспомогательные вещества фосфатидилинозитол глютаматдегидрогеназа сквален